白蛋白(HSA)和0.03%的氫化可的松溶液的生理鹽水溶液中，濃縮液與生理鹽水的體積比為I: 2，制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液。
[0051]作為優(yōu)選的，在培養(yǎng)過程中每隔兩日計(jì)數(shù)細(xì)胞一次，并補(bǔ)加一定量的X-VIVO15培養(yǎng)基、IL-4 和 GM-CSF。
[0052]其中，在培養(yǎng)10天后，抽取IX 16的細(xì)胞進(jìn)行DC細(xì)胞的流式檢測(cè)。
[0053]實(shí)施例3。
[0054]本實(shí)施例提供一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟:
[0055]I)采集患者自身外周血50mL，離心后收集血漿；
[0056]2)將下層血細(xì)胞用生理鹽水進(jìn)行稀釋，再將稀釋液加入已有Ficoll分離液的sepmate離心管中，500g離心20min，血細(xì)胞與生理鹽水的體積比為2:1 ；
[0057]3)將步驟2)中離心后的上層液體從離心管中倒出，再加入25mL的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，500g離心20min ；
[0058]4)分別采用抗⑶14抗體和抗⑶86的抗體磁珠分選出單核細(xì)胞和DC細(xì)胞；
[0059]5)向分選出的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞中加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度為10\105/1^;同時(shí)向培養(yǎng)基中加入10001]/11^的11^-4和10001]/11^的61-03卩，每日觀察0(:細(xì)胞的形態(tài)；
[0060]6)分別在培養(yǎng)的第6天和第8天向培養(yǎng)基中添加500U/mL的TNF-α以促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟；
[0061 ] 7)培養(yǎng)10天后收集DC細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將DC細(xì)胞進(jìn)行裂解；
[0062]8)將裂解后的DC細(xì)胞內(nèi)容物和培養(yǎng)上清中的蛋白濃縮90倍，將濃縮液稀釋在含有5%的人血白蛋白(HSA)和0.05%的氫化可的松溶液的生理鹽水溶液中，濃縮液與生理鹽水的體積比為I: 2，制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液。
[0063]作為優(yōu)選的，在培養(yǎng)過程中每隔兩日計(jì)數(shù)細(xì)胞一次，并補(bǔ)加一定量的X-VIVO15培養(yǎng)基、IL-4 和 GM-CSF。
[0064]其中，在培養(yǎng)10天后，抽取IX 16的細(xì)胞進(jìn)行DC細(xì)胞的流式檢測(cè)。
[0065]實(shí)施例4、DC細(xì)胞蛋白滴眼液治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的臨床效果觀察實(shí)驗(yàn)
[0066]1、基本資料:
[0067]2015年3月?2015年4月在中山大學(xué)眼科醫(yī)院診斷為細(xì)菌性結(jié)膜炎的患者30例50目艮，其中男10例18眼，女20例32眼，年齡25-45歲。
[0068]2、癥狀體征:
[0069 ]刺痛、癢感、分泌物、流淚、眼睛紅腫、瞼結(jié)膜充血。
[0070]3、根據(jù)上述癥狀體征，按照不同程度分為4級(jí):
[0071 ]無、輕度、中度和重度，并依次定位為O分、I分、2分和3分。
[0072]4、實(shí)驗(yàn)方法:
[0073]隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各15例。實(shí)驗(yàn)組使用DC細(xì)胞蛋白滴眼液，對(duì)照組使用
0.5%病毒唑滴眼液(上海集成制藥廠)，均6次/天，I滴/次，連續(xù)治療10天。分別在用藥后7天、14天進(jìn)行復(fù)查，復(fù)查項(xiàng)目包括刺痛、癢感、分泌物、流淚、眼睛紅腫、瞼結(jié)膜充血等項(xiàng)目，所有患者復(fù)查時(shí)均詢問用藥時(shí)是否有刺激感、異物感和眼癢等不適癥狀。
[0074]5、療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):
[0075]按照痊愈、顯效、有效和無效四級(jí)評(píng)定。以治療前后總分值的下降來判斷單個(gè)患者的療效，癥狀體征積分的下降值=治療前積分-治療后積分。
[0076](I)痊愈:第1、第2次復(fù)查時(shí)癥狀體征全消失(總分為O);
[0077](2)顯效:積分減少2 85%且< 100% ;
[0078](3)有效:積分減少2 5O%且<85% ;
[0079](4)無效:積分減少<50%，或癥狀體征加重。
[0080]總有效率=(痊愈病例數(shù)+顯效病例數(shù))/可供評(píng)價(jià)療效病例數(shù)。
[0081 ] 6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0082]實(shí)驗(yàn)組治愈18眼，顯效2眼，有效5眼，總有效率為80.0%(20/25)，對(duì)照組治愈17目艮，顯效I眼，有效4眼，無效3眼，總有效率為72.0% (18/25)，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0083]7、結(jié)論:
[0084]相對(duì)于使用0.5%病毒唑滴眼液治療細(xì)菌性結(jié)膜炎，本發(fā)明的DC細(xì)胞蛋白滴眼液治療細(xì)菌性結(jié)膜炎具有更高的有效率，不僅預(yù)防及治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的效果顯著、不易復(fù)發(fā)，能夠大大減輕患者的痛苦，而且能夠替代現(xiàn)有技術(shù)中普遍使用的抗生素滴眼液，減少了普遍濫用抗生素的問題。
[0085]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，由DC細(xì)胞分泌的蛋白的濃縮液和生理鹽水組成。2.如權(quán)利要求1所述的治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，所述生理鹽水中含有I?5 %的人血白蛋白和0.0l?0.05 %的氫化可的松溶液。3.如權(quán)利要求1所述的治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，所述DC細(xì)胞分泌的蛋白的濃縮液與生理鹽水的體積比為1: 2。4.一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟: 1)采集患者自身外周血50mL，離心后收集血漿； 2)將下層血細(xì)胞用生理鹽水進(jìn)行稀釋，再將稀釋液加入已有Ficoll分離液的sepmate離心管中，300?500g離心10-20min，血細(xì)胞與生理鹽水的體積比為1:2?2:1 ； 3)將步驟2)中離心后的上層液體從離心管中倒出，再加入15?25mL的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，300?500g離心10-20min ； 4)分別采用抗CD14抗體和抗CD86的抗體磁珠分選出單核細(xì)胞和DC細(xì)胞； 5)向分選出的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞中加入X-VIVO15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度為5?10父105/1111^同時(shí)向培養(yǎng)基中加入100-10001]/11^的11^-4和100-10001]/11^的61-05?，每日觀察DC細(xì)胞的形態(tài)； 6)分別在培養(yǎng)的第6天和第8天向培養(yǎng)基中添加50-500U/mL的TNF-α以促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟； 7)培養(yǎng)10天后收集DC細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將DC細(xì)胞進(jìn)行裂解； 8)將裂解后的DC細(xì)胞內(nèi)容物和培養(yǎng)上清中的蛋白濃縮70?90倍，將濃縮液稀釋在含有I?5 %的人血白蛋白(HSA)和0.01?0.05%的氫化可的松溶液的生理鹽水溶液中，濃縮液與生理鹽水的體積比為I: 2，制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液。5.如權(quán)利要求4所述的治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，在培養(yǎng)過程中每隔兩日計(jì)數(shù)細(xì)胞一次，并補(bǔ)加一定量的X-VIVO 15培養(yǎng)基、IL-4和GM-CSF。6.如權(quán)利要求4所述的治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，在培養(yǎng)10天后，抽取I X 16的細(xì)胞進(jìn)行DC細(xì)胞的流式檢測(cè)。7.—種DC細(xì)胞蛋白滴眼液用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液及其制備方法和應(yīng)用，該滴眼液含有DC細(xì)胞分泌的蛋白濃縮物，不僅預(yù)防及治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的效果顯著、不易復(fù)發(fā)，能夠大大減輕患者的痛苦，而且能夠替代現(xiàn)有技術(shù)中普遍使用的抗生素滴眼液，減少了普遍濫用抗生素的問題，制備方法首先對(duì)DC細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后再收集DC細(xì)胞分泌的蛋白，將蛋白進(jìn)行濃縮后與生理鹽水復(fù)配制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液，制備方法簡(jiǎn)單、成本低，本發(fā)明的滴眼液在治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的應(yīng)用中具有顯著的效果，且不易復(fù)發(fā)。
【IPC分類】A61P31/04, A61K9/10, A61P27/02, A61K9/08, A61K38/17, A61K35/15, A61P31/02
【公開號(hào)】CN105640989
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 羅二梅
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年1月15日