一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的dc細(xì)胞蛋白滴眼液及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌性結(jié)膜炎是一種由細(xì)菌感染引起的臨床常見的眼科疾病之一，俗稱“紅眼”或“火眼”。其臨床常見癥狀為結(jié)膜充血、結(jié)膜囊膿性、粘液性或黏膿性分泌物，也是定性和病變程度的診斷依據(jù)。常見的致病細(xì)菌有科一韋桿菌、肺炎雙球菌、流行性感冒桿菌、金黃色葡萄球菌等，一般多在春夏暖和季節(jié)流行，但由肺炎雙球菌引起者多見于冬季。
[0003]該病具有一定的自限性，病程通常在兩周之內(nèi)。雖然該病的診斷和治療不難，但是，若治療不及時或方法不當(dāng)，容易轉(zhuǎn)為慢性結(jié)膜炎，對患者的損傷較大。臨床上通常使用抗生素滴眼液進行治療，雖然可以收到顯著的效果，但復(fù)發(fā)率相對較高，而且臨床上有普遍濫用抗生素的問題，從而導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多，故開發(fā)一種敏感有效的藥物來治療細(xì)菌性結(jié)膜炎是當(dāng)務(wù)之急。
[0004]DC細(xì)胞是一種重要的淋巴細(xì)胞，在機體抗病毒自然免疫中發(fā)揮著重要作用，故將DC細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)菌性結(jié)膜炎的治療無疑具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，含有DC細(xì)胞分泌的蛋白濃縮物，不僅預(yù)防及治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的效果顯著、不易復(fù)發(fā)，能夠大大減輕患者的痛苦，而且能夠替代現(xiàn)有技術(shù)中普遍使用的抗生素滴眼液，減少了普遍濫用抗生素的問題。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供一種DC細(xì)胞蛋白滴眼液用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的用途。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)該目的:
[0009]一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，由DC細(xì)胞分泌的蛋白的濃縮液和生理鹽水組成。
[0010]進一步的，所述生理鹽水中含有I?5%的人血白蛋白和0.01?0.05%的氫化可的松溶液。
[0011 ]作為優(yōu)選的，所述DC細(xì)胞分泌的蛋白的濃縮液與生理鹽水的體積比為1: 2。
[0012]一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟:
[0013]I)采集患者自身外周血50mL，離心后收集血漿；
[0014]2)將下層血細(xì)胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有Ficoll分離液的sepmate離心管中，300?500g離心10_20min，血細(xì)胞與生理鹽水的體積比為1:2?2:1 ；
[0015]3)將步驟2)中離心后的上層液體從離心管中倒出，再加入15?25mL的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，300?500g離心10-20min ；
[0016]4)分別采用抗CD 14抗體和抗CD86的抗體磁珠分選出單核細(xì)胞和DC細(xì)胞；
[0017]5)向分選出的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞中加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細(xì)胞密度為5?10\105/1^;同時向培養(yǎng)基中加入100-10001]/11^的11^-4和100-10001]/11^的61-05?，每日觀察DC細(xì)胞的形態(tài)；
[0018]6)分別在培養(yǎng)的第6天和第8天向培養(yǎng)基中添加50_500U/mL的TNF-α以促進DC細(xì)胞的成熟；
[0019]7)培養(yǎng)10天后收集DC細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將DC細(xì)胞進行裂解；
[0020]8)將裂解后的DC細(xì)胞內(nèi)容物和培養(yǎng)上清中的蛋白濃縮70?90倍，將濃縮液稀釋在含有I?5%的人血白蛋白(HSA)和0.01?0.05%的氫化可的松溶液的生理鹽水溶液中，濃縮液與生理鹽水的體積比為I: 2，制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液。
[0021]作為優(yōu)選的，在培養(yǎng)過程中每隔兩日計數(shù)細(xì)胞一次，并補加一定量的X-VIVO15培養(yǎng)基、IL-4 和 GM-CSF。
[0022 ]其中，在培養(yǎng)1天后，抽取I X 16的細(xì)胞進行DC細(xì)胞的流式檢測。
[0023]一種DC細(xì)胞蛋白滴眼液用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的用途。
[0024]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液，含有DC細(xì)胞分泌的蛋白濃縮物，不僅預(yù)防及治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的效果顯著、不易復(fù)發(fā)，能夠大大減輕患者的痛苦，而且能夠替代現(xiàn)有技術(shù)中普遍使用的抗生素滴眼液，減少了普遍濫用抗生素的問題，制備方法首先對DC細(xì)胞進行擴增培養(yǎng)，然后再收集DC細(xì)胞分泌的蛋白，將蛋白進行濃縮后與生理鹽水復(fù)配制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液，制備方法簡單、成本低，本發(fā)明的滴眼液在治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的應(yīng)用中具有顯著的效果，且不易復(fù)發(fā)。
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例1中培養(yǎng)第2天的DC細(xì)胞形態(tài)圖。
[0026]圖2為實施例1中培養(yǎng)第7天的DC細(xì)胞形態(tài)圖。
[0027]圖3為實施例1中的DC細(xì)胞流式檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0028]以下結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。
[0029]實施例1。
[0030]本實施例提供一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟:
[0031]I)采集患者自身外周血50mL，離心后收集血漿；
[0032]2)將下層血細(xì)胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有Ficoll分離液的sepmate離心管中，300g離心1min，血細(xì)胞與生理鹽水的體積比為1:2;
[0033]3)將步驟2)中離心后的上層液體從離心管中倒出，再加入15mL的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，300g離心1min;
[0034]4)分別采用抗⑶14抗體和抗⑶86的抗體磁珠分選出單核細(xì)胞和DC細(xì)胞；
[0035]5)向分選出的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞中加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細(xì)胞密度為5X 10VmL;同時向培養(yǎng)基中加入100U/mL的IL-4和100U/mL的GM-CSF，每日觀察DC細(xì)胞的形態(tài)，其中培養(yǎng)第2天和第7天的DC細(xì)胞形態(tài)分別如圖1、圖2所示；
[0036]6)分別在培養(yǎng)的第6天和第8天向培養(yǎng)基中添加50U/mL的TNF-α以促進DC細(xì)胞的成熟；
[0037]7)培養(yǎng)10天后收集DC細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將DC細(xì)胞進行裂解；
[0038]8)將裂解后的DC細(xì)胞內(nèi)容物和培養(yǎng)上清中的蛋白濃縮70倍，將濃縮液稀釋在含有I %的人血白蛋白(HSA)和0.01%的氫化可的松溶液的生理鹽水溶液中，濃縮液與生理鹽水的體積比為I: 2，制得DC細(xì)胞蛋白滴眼液。
[0039]作為優(yōu)選的，在培養(yǎng)過程中每隔兩日計數(shù)細(xì)胞一次，并補加一定量的X-VIVO15培養(yǎng)基、IL-4 和 GM-CSF。
[0040]其中，在培養(yǎng)10天后，抽取IX 16的細(xì)胞進行DC細(xì)胞的流式檢測，流式檢測結(jié)果如圖3所示。
[0041 ] 實施例2。
[0042]本實施例提供一種治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的DC細(xì)胞蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟:
[0043]I)采集患者自身外周血50mL，離心后收集血漿；
[0044]2)將下層血細(xì)胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有Ficoll分離液的sepmate離心管中，400g離心15min，血細(xì)胞與生理鹽水的體積比為1:1 ；
[0045]3)將步驟2)中離心后的上層液體從離心管中倒出，再加入20mL的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，400g離心15min;
[0046]4)分別采用抗⑶14抗體和抗⑶86的抗體磁珠分選出單核細(xì)胞和DC細(xì)胞；
[0047]5)向分選出的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞中加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細(xì)胞密度為8X 10VmL;同時向培養(yǎng)基中加入500U/mL的IL-4和500U/mL的GM-CSF，每日觀察DC細(xì)胞的形態(tài)；
[0048]6)分別在培養(yǎng)的第6天和第8天向培養(yǎng)基中添加300U/mL的TNF-α以促進DC細(xì)胞的成熟；
[0049]7)培養(yǎng)10天后收集DC細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將DC細(xì)胞進行裂解；
[0050]8)將裂解后的DC細(xì)胞內(nèi)容物和培養(yǎng)上清中的蛋白濃縮80倍，將濃縮液稀釋在含有3%的人血