莧漿液;按照質(zhì)量體積料液比1:10(g/ml)加 入體積百分比為75%乙醇，在料液溫度為70°C下攪拌提取2h，過(guò)濾掉馬齒莧殘?jiān)玫綖V液 一;將上述濾液一進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濾液無(wú)醇味，然后加水補(bǔ)回原來(lái)濾液的體積，得到濾液 二；向上濾液二中加入質(zhì)量復(fù)配比為1:1的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 5wt%的活性炭和活性白土的復(fù) 配脫色劑，在80°C下脫色30min，并用200nm陶瓷膜過(guò)濾掉活性炭；用20nm的納濾膜截流分子 量小于150-300的濾液，得到濾液三；向上述濾液三中添加基于整個(gè)體系的總質(zhì)量的30wt% 丁二醇作為保濕劑，再加入基于馬齒莧提取液和保濕劑整個(gè)體系的總質(zhì)量的〇. 3wt%膠體銀 離子作為防腐劑，即得馬齒莧提取液，測(cè)試制備得到的馬齒莧提取液的總黃酮含量、穩(wěn)定 性、外觀及多糖含量，測(cè)試結(jié)果如表1所示。
[0026] 對(duì)比例1: 向上濾液二中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.5wt%的活性炭，其他同實(shí)施例1，測(cè)試制備得到的馬齒 莧提取液的總黃酮含量、穩(wěn)定性、外觀及多糖含量，測(cè)試結(jié)果如表1所示。
[0027] 對(duì)比例2: 向上濾液二中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.5wt%的活性白土，其他同實(shí)施例1，測(cè)試制備得到的馬 齒莧提取液的總黃酮含量、穩(wěn)定性、外觀及多糖含量，測(cè)試結(jié)果如表1所示。
[0028] 對(duì)比例3: 沒(méi)有采用200nm的納濾膜截流分子量小于150-300的濾液，其他同實(shí)施例1，測(cè)試制備得 到的馬齒莧提取液的總黃酮含量、穩(wěn)定性、外觀及多糖含量，測(cè)試結(jié)果如表1所示。
[0029] 表1實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3得到的馬齒莧提取液的測(cè)試結(jié)果 功歡評(píng)饑：
1.1細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS)清除率測(cè)試 將實(shí)施例1制備得到的馬齒莧提取液(未加添加保濕劑和防腐劑)放入凍干機(jī)制成新鮮 馬齒莧醇提凍干粉，用強(qiáng)度為20J/cm2的UVA照射HacaT細(xì)胞，然后添加新鮮馬齒莧醇提凍干 粉的量依次為〇、50、100、200ppm，加入熒光試劑HPF，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)試熒光強(qiáng)度;實(shí)驗(yàn)結(jié) 果如圖1和圖2所不。
[0030] 結(jié)論：由圖1可知：添加新鮮馬齒莧醇提凍干粉為50ppm時(shí)，HacaT細(xì)胞內(nèi)氧自由基 (ROS)清除率測(cè)試的清除率達(dá)到了70%;由圖2，熒光強(qiáng)度隨著新鮮馬齒莧醇提凍干粉添加量 的變化而逐漸減弱，表明新鮮馬齒莧醇提凍干粉對(duì)UVA引起的ROS具有較強(qiáng)的清除作用。
[0031] 1.2細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的測(cè)試 將實(shí)施例1制備得到的馬齒莧提取液(未加添加保濕劑和防腐劑)放入凍干機(jī)制成新鮮 馬齒莧醇提凍干粉，用強(qiáng)度為20J/cm2的UVA照射HacaT細(xì)胞，然后添加新鮮馬齒莧醇提凍干 粉的量依次為l〇〇、200ppm;同時(shí)采用空白對(duì)照（不用UVA照射、不添加新鮮馬齒莧醇提凍干 粉)和陰性對(duì)照組（用UVA照射，不添加新鮮馬齒莧醇提凍干粉），然后用WST-I試劑盒，測(cè)試 HacaT細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性，結(jié)果如圖3所示。
[0032] 結(jié)論:和空白組對(duì)比，采用強(qiáng)度為20J/cm2的UVA照射HacaT細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性 增加，隨著新鮮馬齒莧醇提凍干粉的添加量增加，SOD酶活性降低，當(dāng)新鮮馬齒莧醇提凍干 粉在200 ppm時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)的SOD酶活性恢復(fù)正常水平。
[0033] 1.3 DPPH清除率測(cè)試 1) DPPH測(cè)試液的配制：取DPPH 0.0056g溶于40ml 99.9%的乙醇中，超聲5min，使其充 分混勾； 2) 樣品配制：用99.9%乙醇稀釋最終含原溶液(韓國(guó)某公司、國(guó)內(nèi)某公司、本發(fā)明制備得 到的馬齒莧提取液)分別為200ul/ml、400ul/ml、600ul/ml、800ul/ml、lOOOul/ml; 3) 設(shè)立樣品管(T)、樣品對(duì)照管(To)、陽(yáng)性對(duì)照管(C)、和陰性對(duì)照管(C〇)，用5ml離心管 作為反應(yīng)管;按照表2的加樣表建立反應(yīng)體系； 表2加樣表
4) 震蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)30min; 5) 將各反應(yīng)液移取200ul到96孔板中，在520nm處測(cè)定光密度值(OD);實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所 不。
[0034]結(jié)論:本發(fā)明的馬齒莧提取液的清除自由基能力最強(qiáng)，濃度為200ppm時(shí)，本發(fā)明的 馬齒莧提取液的DPPH清除率為31.28%，清除自由基能力是韓國(guó)某公司的3倍，是國(guó)內(nèi)某公司 的8倍。
[0035] 1.4本發(fā)明制備得到的馬齒莧提取物對(duì)3D皮膚炎癥因子表量的影響 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的生存率，其檢測(cè)原理:為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外 源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功 能；二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在 一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比；根據(jù)測(cè)得的吸光度值(0D值），來(lái)判 斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng);結(jié)果如圖5所示。
[0036] 結(jié)論:和超純水進(jìn)行對(duì)照:本發(fā)明制備得到的馬齒莧提取物不會(huì)引起炎癥因子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 稱取新鮮馬齒莧，用粉碎機(jī)粉碎成馬齒莧漿液;加入體積分?jǐn)?shù)為50%-75%的乙醇，水浴 加熱到60°C-80°C，攪拌提取lh-3h，過(guò)濾得到濾液一，將上述濾液一蒸餾回收乙醇，然后加 水補(bǔ)回原來(lái)濾液的體積，得到濾液二；向上述濾液二中加入活性炭與活性白土的復(fù)配脫色 劑，在20°C-80°C下脫色20min-40min，并用陶瓷膜過(guò)濾掉活性炭；用納濾膜截流分子量小于 150-300的濾液，得到濾液三；向上述濾液三中添加保濕劑，再加入防腐劑，即得馬齒莧提取 液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，所述馬齒莧漿液與乙 醇的質(zhì)量體積料液比為1:3-1:10。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，所述活性炭與活性白 土的復(fù)配脫色劑中活性炭與活性白土質(zhì)量比為1:1，基于濾液二的總質(zhì)量，活性炭與活性白 土的復(fù)配脫色劑的添加量為〇. 5wt%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為 100nm-300nm〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，所述納濾膜的孔徑為 20nm-50nm〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，基于整個(gè)體系的總質(zhì) 量，保濕劑的添加量為整個(gè)體系的15%_30%;所述保濕劑選自丙二醇、丁二醇、戊二醇中的一 種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬齒莧提取液的制備方法，其特征在于，基于包括馬齒莧提取 液和保濕劑整個(gè)體系的總質(zhì)量，防腐劑的添加量為0.2wt%-0.5wt%;所述防腐劑選自膠體銀 離子、苯氧乙醇、1、2己二醇中的一種或幾種。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種馬齒莧提取液的制備方法，包括如下步驟：稱取新鮮馬齒莧，用粉碎機(jī)粉碎成馬齒莧漿液；加入體積分?jǐn)?shù)為50%-75%的乙醇，在溫度為60℃-80℃下攪拌提取1h-3h，過(guò)濾得到濾液一，將上述濾液一蒸餾回收乙醇，然后加水補(bǔ)回原來(lái)濾液的體積，得到濾液二；向上述濾液二中加入活性炭與活性白土的復(fù)配脫色劑，在20℃-80℃下脫色20min-40min，并用陶瓷膜過(guò)濾掉活性炭；用納濾膜截流分子量小于150-300的濾液，得到濾液三；向上述濾液三中添加保濕劑，再加入防腐劑，即得馬齒莧提取液。本發(fā)明的馬齒莧提取液制備工藝操作簡(jiǎn)單，便于工業(yè)化生產(chǎn)，且由該制備方法得到的馬齒莧提取液具有很強(qiáng)的抗UVA、清除自由基和體外抗氧化特性，且不會(huì)引起炎癥因子。
【IPC分類】A61K8/97, A61K8/19, A61Q19/08, A61K8/34, A61Q17/04, A61Q19/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105640842
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】何廷剛, 張兵, 朱思陽(yáng), 陳洪, 艾勇, 黃垂凡
【申請(qǐng)人】廣州市禾基生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年2月24日...