NA。采用通用引 物（27f: 5，-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3，；1492r: 5，-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）進(jìn)行 16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50ul):lXTaq PCR Master Mix 25yL，DNA 模板 lyL(O.l-lOng)，引物（10ymol/L)各 2 yL，ddH20 20μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min，4°C終止反 應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于_20°C冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限 公司進(jìn)行純化，雙向測(cè)序并拼接輸出全序列。
[0020] 將獲得的DNA序列（見(jiàn)Seql)，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast檢測(cè)并下載已測(cè)序列的相 似序列和參考序列。運(yùn)用軟件Clu StalX(Versi〇n 1.83)對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)。選取其中6個(gè)典 型菌株的16SrDNA序列，以小單抱菌屬種類(lèi)Micromonospora viridifaciens為外群，運(yùn)用 分析軟件M e g a 6.0 6中的鄰位相連法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果表明，菌株D T J - 2 4與 Streptomyces lavenduIae聚類(lèi)在一個(gè)分支上（圖2)。因此，結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及 16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株DTJ-24鑒定為淡紫灰鏈霉菌(S. Iavendulae)。
[0021] 實(shí)施例3拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液的制備 將菌株DTJ-24接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量70%，發(fā)酵罐體積30L，在攪拌速度150-200rpm/min、通氣量15-20%、溫度25-30°C、pH值6.5~7.5條件下，進(jìn)行恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵5 天后，發(fā)酵液5000r/min離心處理，制備上清液，上清液采用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，制備無(wú)菌發(fā)酵濾 液。
[0022]液體培養(yǎng)基配方如下：酵母浸粉4.0g/L，麥芽浸粉10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，水 1000ml，pH值7.5。
[0023] 實(shí)施例4盆栽試驗(yàn) 為了檢驗(yàn)菌株DTJ-24無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)軟棗獼猴桃干腐病的生防效果，進(jìn)行了本試驗(yàn)。 試驗(yàn)于2015年4-6月進(jìn)行，試驗(yàn)用軟棗獼猴桃苗1年生，生長(zhǎng)勢(shì)均一，栽培基質(zhì)為軟棗獼猴桃 栽培基地土壤，栽培裝置為營(yíng)養(yǎng)缽(規(guī)格30cm X 30cm) 〇
[0024] I、軟棗獼猴桃移植 自遼寧丹東軟棗獼猴桃種植基地挖土備用。稱(chēng)取適量土，混入2 %有機(jī)肥，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽 中裝入3.5公斤混土。在營(yíng)養(yǎng)缽中裝滿(mǎn)基質(zhì)后略壓緊，然后移入1株軟棗獼猴桃苗，根據(jù)需要 補(bǔ)充水分，15d后待軟棗獼猴桃生長(zhǎng)穩(wěn)定進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0025] 2、病原菌孢子懸液制備 將軟棗獼猴桃干腐病病原菌接種于PDA試管斜面中27°C培養(yǎng)7d。取已培養(yǎng)好的病原菌 斜面菌種一支，加入5ml無(wú)菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，該孢子懸浮液置于已滅菌 50ml三角瓶?jī)?nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒無(wú)菌玻璃球，充分振搖后用滅菌的脫脂棉進(jìn)行過(guò)濾，并用 無(wú)菌水沖洗濾渣2~3次，最終使濾液體積達(dá)到10.0 ml，得孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)孢子 懸液濃度，最終制備5.0 X IO5個(gè)/ml的病原菌孢子懸液。
[0026] 3、拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液的制備:方法見(jiàn)實(shí)施例2。
[0027] 4、病原菌感染軟棗獼猴桃 用無(wú)菌刀片在健康的試驗(yàn)軟棗獼猴桃樹(shù)干部位劃出0.5cm長(zhǎng)十字傷口，用移液器在軟 棗獼猴桃樹(shù)干劃傷部位接種5ul步驟2中制備的病原菌孢子液，培養(yǎng)48h。
[0028] 5、莖部噴施防效 用步驟3制備的無(wú)菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液進(jìn)行莖部噴施，將藥液均勻的噴灑在莖部， 以滴水為度;無(wú)菌水噴施作為陰性對(duì)照;咪鮮胺1000倍稀釋液噴施作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理 組20株，3次重復(fù)。每隔15天噴藥1次，連續(xù)噴施3次，于45d后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算防治效果， 結(jié)果見(jiàn)表1。
[0029] 6、灌根處理防效:用步驟3制備的無(wú)菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液100mL進(jìn)行灌根處理； 無(wú)菌水處理作為陰性對(duì)照；咪鮮胺1000倍稀釋液處理作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理組20株，3次 重復(fù)。每隔15天用藥1次，連續(xù)處理3次，于45d后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算防治效果，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0030] 軟棗獼猴桃干腐病樹(shù)干的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí):無(wú)?。?級(jí)：發(fā)病部出現(xiàn)淺褐色斑點(diǎn)， 病斑平均長(zhǎng)度<1.0 cm;3級(jí):病斑沿樹(shù)干方向向兩側(cè)擴(kuò)大，病斑平均長(zhǎng)度在1.1~5.0 cm;5 級(jí)：出現(xiàn)典型的病斑，病斑平均長(zhǎng)度在5.1~9.0 cm:7級(jí):病斑擴(kuò)大，平均長(zhǎng)度為9.1~15.0 cm;9級(jí):發(fā)病樹(shù)干的葉片出現(xiàn)萎蔫，病斑平均長(zhǎng)度>15 · 0 cm〇
[0031] 病情指數(shù)=[Σ (各級(jí)病株數(shù)X對(duì)應(yīng)各級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)X發(fā)病最高級(jí)值）]X 100。相對(duì)防效(％)=[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]X 100。
[0032]表1莖部噴施防治效果
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異不 顯著（Ρ>0·05) 表2灌根處理防治效果_
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異不 顯著（Ρ>0·05) 由表1、2可見(jiàn)，菌株DTJ-24無(wú)菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液與化學(xué)農(nóng)藥咪鮮胺1000倍稀釋液 處理相比無(wú)明顯防效差異，且防治效果良好。兩種不同的施用方式:莖部噴施和灌根處理均 能達(dá)到較好的防治效果。因此與施用化學(xué)農(nóng)藥相比，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，使用方便，可 以降低軟棗獼猴桃栽培過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的使用，具有安全環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)及良好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā) 前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用。2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，一株淡紫灰鏈霉菌的無(wú)菌發(fā)酵濾液用于防治軟 棗獼猴桃干腐病。3. 權(quán)利要求2所述的無(wú)菌發(fā)酵濾液用于防治軟棗獼猴桃干腐病，其特征在于，施用時(shí)， 將無(wú)菌發(fā)酵濾液按比例1:100與水沖兌后，直接噴施于軟棗獼猴桃莖部或灌于軟棗獼猴桃 根部。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用，涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一株淡紫灰鏈霉菌保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC？No.9972。本發(fā)明使用一株淡紫灰鏈霉菌的無(wú)菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液直接噴施于軟棗獼猴桃莖部或灌于軟棗獼猴桃根部，對(duì)軟棗獼猴桃干腐病防效可達(dá)88.6%。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，使用方便，可以降低軟棗獼猴桃栽培過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的使用，具有安全環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，及良好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。CGMCC No.997220141114
【IPC分類(lèi)】A01P3/00, A01N63/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105638746
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李娟 , 王旭, 王東來(lái)
【申請(qǐng)人】遼東學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日