一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 軟率稱猴桃Actinidia arguta (Sieb·et Zucc· )Planch· Ex Miq·又名軟率子、 獼猴梨、藤瓜、藤梨，屬于獼猴桃科，獼猴桃屬大型落葉藤本。軟棗獼猴桃果實較小，表面光 滑，整果可食，營養(yǎng)豐富，是一種新興的商品性水果，已被加拿大、智利、法國、新西蘭以及美 國等國家引進并大面積栽培。國內(nèi)軟棗獼猴桃商業(yè)化栽培剛剛興起。目前，遼寧丹東栽培面 積已達(dá)10000多畝，是國內(nèi)軟棗獼猴桃栽培面積最大的地區(qū)。
[0003] 近兩年來，丹東地區(qū)軟棗獼猴桃種植園出現(xiàn)了一種新病害即軟棗獼猴桃干腐病。 該病主要發(fā)生在春季，受害軟棗獼猴桃的干基部形成深褐色的病斑，病斑向上擴大，剖開受 害組織，皮層變深褐色，韌皮部與木質(zhì)部分離，韌皮部表面有白色菌絲。經(jīng)鑒定，軟棗獼猴桃 干腐病病原菌為擬莖點霉屬真菌Diaporthe nobilis Sacc. & Speg.。該病原菌主要通過 軟棗獼猴桃莖基部凍傷部位感染，導(dǎo)致植株韌皮部和木質(zhì)部受損，影響水分、養(yǎng)分運輸，造 成植株生長勢變?nèi)跎踔廖?。該病危害?yán)重，田間發(fā)病率約為20%，嚴(yán)重影響軟棗獼猴桃產(chǎn) 量。
[0004] 目前該病主要采用田間管理和化學(xué)藥劑防治，但效果不理想。大量使用化學(xué)農(nóng)藥 使病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時造成環(huán)境污染。利用拮抗微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物對作物病害進行 生物防治能夠避免環(huán)境二次污染，被認(rèn)為是植物病害防治的綠色安全措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐病中的應(yīng)用，以 解決化學(xué)農(nóng)藥防治帶來的環(huán)境污染和果實農(nóng)藥殘留問題。
[0006] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一株淡紫灰鏈霉菌在防治軟棗獼猴桃干腐 病中的應(yīng)用，其特征在于，一株淡紫灰鏈霉菌的無菌發(fā)酵濾液用于防治軟棗獼猴桃干腐病。
[0007] 上述無菌發(fā)酵濾液的制備方法如下：將淡紫灰鏈霉菌菌株接種于液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)基裝量70%，發(fā)酵罐體積30L，在攪拌速度150-200rpm/min、通氣量15-20%、溫度25-30 °C、pH值6.5~7.5條件下，進行恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵5天后，發(fā)酵液5000r/min離心處理，制備 上清液，上清液采用無菌濾膜過濾，制備無菌發(fā)酵濾液。
[0008] 為了檢驗上述無菌發(fā)酵濾液對軟棗獼猴桃干腐病的防治效果，進行了盆栽試驗。 結(jié)果表明：淡紫灰鏈霉菌無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液采用莖部噴施和灌根處理均能達(dá)到較 好的防治效果，防效分別達(dá)86.7%、88.6%。
[0009] 上述無菌發(fā)酵濾液用于防治軟棗獼猴桃干腐病的使用方法:施用時，將無菌發(fā)酵 濾液按比例1:100與水沖兌后，直接噴施于軟棗獼猴桃莖部或灌于軟棗獼猴桃根部。
[0010] 本發(fā)明的一株淡紫灰鏈霉菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心進行保藏，保藏編號為:CGMCC No.9972;保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，郵編100101。 保藏日期為:2014年11月14日。
[0011] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的一株淡紫灰鏈霉菌的無菌發(fā)酵濾液對軟棗獼猴 桃干腐病具有較好的防治效果，為軟棗獼猴桃干腐病的防治提供了一種有效、無毒、無殘 留、環(huán)境友好的生物防治新途徑。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌DTJ-24基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖2是 本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌DTJ-24對棗獼猴桃干腐病病原菌的拮抗作用。
【具體實施方式】
[0013] 以下結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細(xì)地闡述。以下實施例僅用于說 明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0014] 實施例1拮抗菌的分離篩選 1、分離純化 2013年6月-2015年8月，采用五點取樣法自遼寧省鳳城、東港、寬甸等地采集土壤樣品 50份。采集的土壤樣品，自然風(fēng)干。取土樣IOg，置于裝有90ml無菌水的三角瓶中，在搖床上 震蕩20min。置30s后，依次稀釋10倍，制備HT 4稀釋液。微量移液器吸取HT4稀釋液0.1ml至 高氏一號培養(yǎng)基固體平板上，無菌涂布器涂布均勻。25°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3-5天。挑取 平板上不同菌落形態(tài)的菌株轉(zhuǎn)接至高氏一號培養(yǎng)基上獲得純培養(yǎng)，滅菌石蠟油封藏，4°C保 藏備用。高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0g，硝酸鉀l.Og，氯化鈉 0.5g，K2 ΗΡ〇4 · 3H20 0.5g，MgS〇4 · 7H20 0.5g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 O.Olg，瓊脂20.0g，水 1000ml，調(diào)整pH值到7.2。
[0015] 2、篩選 初篩：以軟率獼猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis為指示菌，采用平板對峙法進行 拮抗菌初篩。指示菌活化后，用直徑0.6cm的無菌打孔器制備菌塊。將病原菌接種于PDA平板 中央，25 °C培養(yǎng)24h。在距離病原菌3cm處對稱接種待測菌株，以不接待測菌株為對照，每個 處理重復(fù)3次。置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對照長滿整個平板，測量抑菌帶寬度，挑選抑菌較 明顯的菌株進行復(fù)篩（圖I ) ADA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 . Og，葡萄糖10 . Og，瓊脂20 . Og，水 1000ml，自然pH。
[0016] 復(fù)篩：以軟棗獼猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis為指示菌，采用發(fā)酵液生長 速率法進行拮抗菌復(fù)篩：初篩獲得的拮抗菌接種于高氏一號液體培養(yǎng)基中，25°C、轉(zhuǎn)速 160r/min，恒溫振蕩器中培養(yǎng)3天，發(fā)酵液離心去菌體，無菌濾膜過濾后濾液備用。取濾液 IOml與90ml冷卻至60°C的HM混合均勻后倒平板，用直徑0.6cm打孔器制備病原菌菌塊，接 種于培養(yǎng)皿中心，以無菌水處理為對照。每個處理重復(fù)3次，25°C培養(yǎng)至對照菌落長滿整個 平板，測量處理菌落直徑，求出抑菌率。篩選出對軟棗獼猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis具有較強拮抗作用的菌株DTJ-24,其抑菌率達(dá)85.1%。
[0017] 實施例2拮抗菌株的鑒定 1、形態(tài)學(xué)鑒定及生化特征 菌落形態(tài):菌株DTJ-24在高氏一號培養(yǎng)基上氣生菌絲紫丁香色、基內(nèi)菌絲無色，無可溶 色素；顯微形態(tài):在顯微鏡下基內(nèi)菌絲無隔膜，不斷裂;氣生菌絲多分枝，且分枝較短，孢子 絲長，螺旋形，孢子橢圓形至柱形，表面光滑。
[0018] 生化特征:菌株DTJ-24能夠使明膠液化，淀粉水解弱。產(chǎn)生硫化氫、能分解纖維素、 牛奶胨化、不凝固。可以利用葡萄糖、果糖，不利用蔗糖、肌醇、甘露醇，棉子糖、D-木糖。
[0019] 2、16SrDNA 序列分析 將菌株DTJ-24接種于高氏一號液體培養(yǎng)基，25 °C搖床培養(yǎng)3d，離心收集菌體。采用生工 生物工程(上海)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組D