結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋 白及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大量結(jié)核感染病例的存在和常規(guī)藥物對結(jié)核感染進行治療面臨著很大困境。尤其 是耐藥結(jié)核分枝桿菌特別是多重耐藥菌的出現(xiàn)對人類健康構(gòu)成了極大威脅，這類耐藥細菌 導(dǎo)致的結(jié)核面臨無藥可用的境地，已成為結(jié)核病防治的巨大障礙。如何有效地根治結(jié)核感 染特別是耐藥結(jié)核感染已經(jīng)成為當(dāng)前許多國家結(jié)核病防治工作面對的難題。尋找新的有效 的抗結(jié)核分枝桿菌制劑已經(jīng)成為刻不容緩的問題。
[0003] 噬菌體制劑作為新型的治療方法，受到越來越廣泛的關(guān)注。噬菌體具有高度專一 的宿主選擇性，噬菌體殺滅宿主菌具有高度特異性，不會影響其他菌群，不會破壞體內(nèi)微生 態(tài)的平衡，也不引起胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)等。實驗證明噬菌體治療細菌感染具有很高的有 效性和安全性。噬菌體治療細菌感染具有許多優(yōu)勢，尤其是耐藥菌的感染。例如耐甲氧西林 的金黃色葡萄球菌(MRSA)的治療是臨床上面臨的棘手的問題，Capparelli等人利用噬菌體 來控制MRSA的感染，取得了良好的效果，研究結(jié)果顯示MRSA噬菌體在體內(nèi)和體外都可以殺 滅巨噬細胞內(nèi)部的MRSA。
[0004] 目前噬菌體全菌治療體內(nèi)細菌感染遇到的最大瓶頸，一是較難實現(xiàn)體內(nèi)靶向性給 藥;二是機體免疫系統(tǒng)對噬菌體的清除也是噬菌體治療中必須解決的一個重要問題。此外 機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對噬菌體的中和抗體，引起噬菌體失活，為了避免出現(xiàn)這一情況，需要 找到降低噬菌體免疫原性的方法。
[0005] 噬菌體對宿主菌的溶解是由噬菌體自身溶菌蛋白介導(dǎo)的溶解系統(tǒng)完成的。溶菌蛋 白是一類細胞壁裂解酶類，它與細菌細胞壁的糖基特異性結(jié)合，發(fā)揮作用;而這種細胞壁糖 基具有種屬特異性。為了克服活性噬菌體制劑的局限性，人們探索了提純噬菌體的特異性 溶菌蛋白作為抗菌制劑治療細菌感染。例如研究表明，純化的噬菌體溶菌蛋白Cpl-1在肺炎 鏈球菌引起的心內(nèi)膜炎和細菌性腦膜炎的試驗中，顯示出了良好的抗菌活性。噬菌體編碼 的溶菌蛋白不僅能高效的殺滅耐藥葡萄球菌屬細菌引起的感染菌而且在體內(nèi)無殘留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的較難實現(xiàn)體內(nèi)靶向性 給藥和產(chǎn)生噬菌體免疫原性最終會導(dǎo)致噬菌體失活的不足，提供一種具有靶向殺滅結(jié)核分 枝桿菌的來源于噬菌體的融合雙組份溶菌蛋白。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是:提供一種結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌 蛋白的制備方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是:提供一種結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌 蛋白在制備治療結(jié)核分枝桿菌感染的藥物中的用途。
[0009] 為解決上述第一個技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:將兩段編碼噬菌體溶菌蛋白 的基因序列在噬菌體溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物作用下經(jīng)過擴增、連接、構(gòu)建載體、轉(zhuǎn) 化、表達、純化后制得結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋白。所述噬菌體溶菌蛋白1引物為 包含以下序列的引物：
[0010] 溶菌蛋白1LB上游：
[0011] 5 '-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3 '
[0012]溶菌蛋白1LB下游：
[0013] 5，-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3 '
[00M]所述·菌體溶菌蛋白2引物為包含以下序列的引物：
[0015] 溶菌蛋白2HN上游：
[0016] 5 '-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3 '
[0017] 溶菌蛋白2HN下游：
[0018] 5 '-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3，
[0019] 優(yōu)選的，所述菌體溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物為：
[0020] 溶菌蛋白1LB上游：
[0021 ] 5 '-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3 '
[0022] 溶菌蛋白1LB下游：
[0023] 5，-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3 '
[0024] 溶菌蛋白2HN上游：
[0025] 5 '-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3 '
[0026] 溶菌蛋白2HN下游：
[0027] 5 '-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3，
[0028] 為解決上述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0029] a.設(shè)計引物(如上所述引物)對噬菌體的溶菌蛋白1(命名為LB)和溶菌蛋白2(命名 為HN)進行PCR擴增；
[0030] b.使用linker將兩段序列連接獲得連接基因；
[0031 ] c.將連接基因連接入原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并進行鑒定；
[0032] d .將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達載體，并在體外誘導(dǎo)進行融合雙組份溶菌蛋白表 達；
[0033] e.對表達后的蛋白進行鑒定并純化表達出的蛋白，得到目的蛋白；
[0034] f.將獲得的融合雙組份溶菌蛋白進行殺菌實驗研究。
[0035]優(yōu)選的，所述的噬菌體為D29噬菌體；
[0036]優(yōu)選的，所述原核表達質(zhì)粒為pET32a;
[0037] 優(yōu)選的，所述的原核表達載體為E.coli BL21。
[0038] 為解決上述第三個技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：該結(jié)核桿菌噬菌體雙組份融 合溶菌蛋白在制備治療結(jié)核分枝桿菌感染的藥物中的用途。
[0039] 由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：1)具有殺菌高效性:聯(lián)合應(yīng)用雙 組份溶菌蛋白，來實現(xiàn)對結(jié)核分枝桿菌的多靶點高效殺滅。2)具有良好靶向性:結(jié)合靶位在 結(jié)核分枝桿菌的細胞壁和細胞膜上，不存在很難滲透穿過結(jié)核分枝桿菌特殊堅韌的細胞壁 的阻礙，具有明顯的殺滅結(jié)核分枝桿菌的效應(yīng)，而對真核細胞與其他細菌無明顯毒副作用。 3)具有良好的生物安全性:解決了全噬菌體具有較強的免疫原性的問題。4)廉價獲得:可在 體外大量表達進行純化。
【附圖說明】
[0040]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0041 ]圖1融合LB-linker-HN的PCR擴增結(jié)果(A)與重組載體酶切鑒定結(jié)果(B);
[0042] 圖2 LB-linker-HN重組蛋白的表達；
[0043] 圖3 LB-linker-HN的純化及Westernblot鑒定；
[0044] 其中，圖 1:泳道 1:LB-linker-HN的PCR結(jié)果；
[0045] 泳道 2: pET32a-( LB-linker-HN)酶切鑒定；
[0046] 泳道M:DNA Marker
[0047] 圖2:泳道Ml:蛋白質(zhì)Marker;
[0048] 泳道2:空菌誘導(dǎo)；
[0049] 泳道3:重組菌誘導(dǎo) [0050] 泳道4:重組菌誘導(dǎo)
[0051 ] 圖3:泳道Ml:蛋白質(zhì)Marker;
[0052] 泳道1:純化蛋白質(zhì)；
[0053] 泳道2:空菌；
[0054] 泳道3:重組蛋白
【具體實施方式】
[0055]下面結(jié)合附圖和實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0056] 實施例1:原核表達載體pET32a-(LB-linker_HN)的構(gòu)建：
[0057]按病毒基因組DNA抽提試劑盒(大連TaKaRa公司）的說明書提取D29噬菌體基因組 DNA。根據(jù)GenBank登錄的D29噬菌體溶菌蛋白1(命名為LB)與溶菌蛋白2(命名為HN)編碼序 列設(shè)計上游引物、下游引物，由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成。
[0058] LB 上游：
[0059 ] 5 '-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3