絲膠蛋白神經導管及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種絲膠蛋白神經導管及其制備方法與應用，屬于醫(yī)學生物材料領 域。
【背景技術】
[0002] 外周神經損傷是較為常見的疾病，通常由交通事故、自然災害、戰(zhàn)爭等導致的創(chuàng)傷 以及腫瘤切除、先天畸形等原因造成，約有2. 8%的創(chuàng)傷病可導致外周神經損傷，造成神經 斷裂。外周神經損傷通常導致病人的感覺和運動功能障礙，致殘率高，嚴重影響病人的生活 質量，給家庭、社會帶來巨大的經濟負擔。
[0003] 外周神經損傷治療原則是盡可能早地恢復神經的連續(xù)性，目前的治療方法主要有 自體神經移植、異體神經移植、斷端無張力直接縫合和組織工程方法。其中，自體神經移植 修復效果較好，但有以下弊端：I )截取供體神經既帶來副損傷，又會導致供體神經支配的 區(qū)域感覺缺失；II )供體限制取材的長度；III)在截取供體神經的位置還可能因此形成神 經瘤而需要再次手術。異體神經移植存在免疫排斥反應等問題。而斷端無張力直接縫合 的治療方法通常會導致神經瘤或瘢痕組織的形成從而阻礙神經的修復，并且僅局限于〈5_ 的短距離外周神經損傷。
[0004] 相比之下，運用組織工程方法修復外周神經損傷是較理想的治療方法，也是目前 外周神經損傷與再生的研究重點。組織工程方法主要是利用神經導管連結損傷神經的兩個 斷端，并促使神經細胞在神經導管上粘附、增殖、迀移和定向排列，從而誘導神經再生，達到 恢復神經連續(xù)性的目的。
[0005] 制備神經導管的材料可使用如聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚L-乳酸 (PLLA)、聚苯醚（PPE)、聚乙交己內酯（PGCL)和聚甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯 (PHEMA-MMA)等人工合成材料。然而，采用人工合成材料制備神經導管的工藝比較復雜，產 品價格昂貴，且部分材料降解產物對人體具有毒副作用（如PLGA等降解產物為酸性）。
[0006] 或者，也可以采用如海藻酸鹽、殼聚糖、膠原和絲素等等的天然材料制備神經導 管，其具有良好的生物相容性，對人體無毒副作用。但這類材料性能不穩(wěn)定，因宿主酶環(huán)境 的變化而不易其調節(jié)降解性能，且其機械加工性能較差，難以實現規(guī)?；a；此外，上述 天然材料制作的神經導管對于短距離的神經損傷（利用大鼠作為動物模型，1〇_及以下的 神經損傷）具有較好的恢復效果，而對于長距離神經損傷（利用大鼠作為動物模型，超過 15mm的神經損傷）在結構和功能方面的恢復均不夠理想，難以達到與自體神經移植相當的 水平。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明提供一種絲膠蛋白神經導管，具有良好生物活性和生物相容性，能促進神 經細胞粘附、增殖、迀移和定向排列，可以在體內自然降解并促進長距離損傷的外周神經再 生，同時所述絲膠蛋白神經導管具有優(yōu)良的物理機械性能。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述絲膠蛋白神經導管的制備方法，工藝簡單，成本低廉，同時 有利于產品的質量控制以及大規(guī)模生產。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述絲膠蛋白神經導管在制備神經移植物中的應用。
[0010] 本發(fā)明首先提供一種絲膠蛋白神經導管，其成分為絲膠蛋白。絲膠蛋白是包裹在 絲素纖維表層的一種天然大分子蛋白，具有良好的生物相容性和生物降解性，可在修復完 成后完全降解，且降解產物為氨基酸（主要為絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸），降解產物不僅 對機體無毒，能被機體代謝，且具有神經營養(yǎng)作用。本發(fā)明人研究發(fā)現絲膠蛋白具有支持神 經細胞的黏附、增殖、迀移與生長等特性，是用于神經修復的理想生物材料。
[0011] 進一步地，本發(fā)明提供的絲膠蛋白神經導管是采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶 繭作為原料提取絲膠蛋白，并經共價交聯劑交聯成型后獲得的。其中，家蠶絲素缺失型突變 品種蠶繭可以購自中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，該類品種資源保存于中國農業(yè)科學院蠶業(yè) 研究所國家蠶資源保存中心。
[0012] 由于絲膠蛋白優(yōu)異的生物相容性和生物活性，該絲膠蛋白神經導管尤其可應用于 長距離外周神經損傷的修復與再生。例如該絲膠蛋白神經導管的尺寸可為：內徑1~3mm， 管壁厚0. 5~1mm，長度15~30mm。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種上述絲膠蛋白神經導管的制備方法，包括以下步驟：
[0014] 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并經紫外線或乙醇滅 菌，然后使用LiBr或LiCl水溶液進行絲膠蛋白的提取，將提取物制成濃度為0. 5~20wt % 的絲膠蛋白水溶液；
[0015] 在所述絲膠蛋白水溶液中加入共價交聯劑，混勻后注入模具中成型，得到絲膠蛋 白神經導管半成品，所述共價交聯劑的使用量為每1毫升絲膠蛋白水溶液加入2~500 μ L 濃度為〇. 1~50wt %的共價交聯劑；
[0016] 將所述絲膠蛋白神經導管半成品冷凍干燥，得到所述絲膠蛋白神經導管。
[0017] 其中，粉碎為可以采用剪刀將蠶繭剪碎或其他能使其破碎的方法。滅菌方法可 采用紫外照射法，把蠶繭粉碎成1mm2左右，用紫外線分別照射正反面至少5min ;或者采用 乙醇浸泡法，將蠶繭粉碎成1mm2左右，用70%~80%體積濃度的乙醇至少浸泡5min，在 3500r/min條件下離心5分鐘，去掉乙醇；還可以將上述紫外照射法和乙醇浸泡法聯合應 用，先用紫外線照射正反面，再用乙醇浸泡，然后離心去掉乙醇。上述三種方法均可達到滿 意的滅菌效果。
[0018] 進一步地，制取所述絲膠蛋白水溶液的方法包括：
[0019] 1)采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并滅菌，在25~ 50°C，采用濃度為6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液，在25~50°C進行提取處理5~24 小時，每克蠶繭碎片采用20~100mL 6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液進行提?。?br>[0020] 2)將步驟1)得到的提取物離心，去除不溶性物質，得到澄清溶液；
[0021] 3)向步驟2)得到的澄清溶液中加入0· 5-3mol/L、pH 8. 0~11. 0的Tris-HCl緩 沖液，并在超純水中進行透析；
[0022] 4)將步驟3)得到的透析液離心去除沉淀，濃縮得到濃度為0.5~20wt%的絲 膠蛋白水溶液。在本發(fā)明的一個實施例中，可使所述絲膠蛋白水溶液的濃度為1. 5~ 15. Owt%，以取得更好的交聯效果
[0023] 上述絲膠蛋白水溶液的制備過程在無菌環(huán)境中操作，所用原料和設備均經滅菌處 理，例如，所用的超純水、透析袋用前均采用高壓滅菌，所用的LiBr水溶液、三羥甲基氨基 甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)、交聯劑均經過0. 22um濾器過濾除菌，乙醇為經過親水性0. 22um濾 器過濾后，用滅菌的超純水配置而成。
[0024] 上述共價交聯劑可選擇戊二醛、丙二醛和京尼平等中的一種或多種。例如，本發(fā)明 的一個實施例中可使用濃度為〇. 1~25wt%的京尼平。
[0025] 進一步地，在所述絲膠蛋白水溶液中加入所述共價交聯劑，混勻后注入模具，在 4~45°C下維持至少5秒使之成型，得到絲膠蛋白神經導管半成品。在一個【具體實施方式】 中，可將其置于室溫下5~15秒成型。在此過程中，絲膠蛋白在交聯劑的作用下發(fā)生交聯 反應，得到絲膠蛋白神經導管半成品。
[0026] 為了利于增加神經導管的孔隙度，可將絲膠蛋白神經導管半成品冷凍干燥之前， 在零度以下冷凍成型，例如，置于_2〇°C至_190°C下（一般可以置于液氮中）冷凍至少4小 時，可更有利于負載生長因子和藥物等。
[0027] 上述絲膠蛋白神經導管（尺寸可