一種與瘦肉精特異結(jié)合的核酸適配體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與瘦肉精特異結(jié)合的核酸適配體及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸克倫特羅是一種興奮劑，將其添加到飼料中，用量大、使用的時(shí)間長、代 謝慢。鹽酸克倫特羅屬于非蛋白質(zhì)激素，耐熱，使用后會在豬體組織中形成殘留，尤其是在 豬的肝臟等內(nèi)臟器官殘留較高，食用后直接危害人體健康。其主要危害是出現(xiàn)肌肉振顫、心 慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者 危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。因此，如何快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測出瘦肉精防患于未然已 成為亟待解決的問題。
[0003] 核酸適配體是通過SELEX技術(shù)，從特定的寡核苷酸庫中篩選得到的，能與靶分子 特異性、高親和力地結(jié)合的一類寡核苷酸分子（DNA或RNA)。由于其具有靶分子范圍廣、分 子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，核酸適配體在臨床診斷鑒定和 疾病治療領(lǐng)域中顯示出了重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 發(fā)明人將本發(fā)明的瘦肉精特異性核酸適配體的核苷酸序列和基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了 比對搜索，未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與瘦肉精特異性結(jié)合的核酸適配體，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :1所示；該核酸適配體為單鏈DNA，由84個核苷酸組成，拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)為直鏈狀； 預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，且存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-16. 04。
[0006] 本發(fā)明另一目的是將與瘦肉精特異性結(jié)合的核酸適配體應(yīng)用在識別瘦肉精或在 制備檢測瘦肉精的試劑盒中。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 1、 瘦肉精特異性核酸適配體（E08)的篩選、克隆、分離和測序 采用SELEX技術(shù)篩選出能夠與瘦肉精特異性結(jié)合的核酸適配體群體，設(shè)計(jì)引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增、克隆、分離和測序。利用酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗(yàn)（ELONA)進(jìn)行驗(yàn)證，得到 適配體E08,它能夠高親和力高特異性的結(jié)合瘦肉精。配體接頭引物序列為：Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC;反向互補(bǔ)序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互補(bǔ)序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所獲陽性單克隆進(jìn)行 核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明與瘦肉精特異性結(jié)合的核酸適配體（E08)由84個核苷酸組 成，其序列（5'端至3'端）為： tgctagacga tattcgtcca tccggcgggg caaattcgcg aagagtctct cggcggatgt accgctgtca gactgaatat gtca ； 2、 核酸適配體（E08)單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)表征 使用 MFOLD 軟件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)對與 瘦肉精特異性結(jié)合的核酸適配體E08單鏈DNA分子進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，其二級結(jié) 構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，且存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-16. 04,顯示該結(jié)構(gòu)具有較 高的穩(wěn)定性；其二級結(jié)構(gòu)如下：
3、核酸適配體（E08)的特異性和對瘦肉精的敏感性 根據(jù)核酸適配體E08的序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法合成生物素標(biāo)記的核酸適配體，建立了 一種新型的酶聯(lián)寡核苷酸檢測方法，通過此方法對E08的特異性和其對瘦肉精的敏感性進(jìn) 行檢測；結(jié)果顯示，E08具有很高的特異性，其能檢測到瘦肉精的最低濃度為4 ng/ μ L。
[0008] 本發(fā)明的意義在于： 利用SELEX技術(shù)篩選出的配體Ε08能夠高親和力高特異性的識別并結(jié)合瘦肉精；核酸 適配體Ε08的鑒別對于食品中殘留的瘦肉精的檢測，進(jìn)而降低瘦肉精對人體的侵害具有重 要意義。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明中⑶圓二色譜法對K+濃度與核酸適配體Ε08的關(guān)系的分析； 圖2為本發(fā)明中ELONA法對核酸適配體E08的特異性分析，圖中：空白對照1為瘦肉精 +脫脂奶；空白對照2 :瘦肉精+不含配體的生物素；陰性對照1為蘇丹紅+標(biāo)記有生物素 的配體E08 ;陰性對照2為α -鵝膏毒肽+標(biāo)記有生物素的配體E08 ;陰性對照3為草甘膦 +標(biāo)記有生物素的配體E08 ;陰性對照4為三聚氰胺+標(biāo)記有生物素的配體E08 ;陰性對照 5為乙型腦炎NSl蛋白+標(biāo)記有生物素的配體E08 ;陰性對照6為乙型腦炎core蛋白+標(biāo) 記有生物素的配體E08 ;瘦肉精：瘦肉精40 ng/μ L +標(biāo)記有生物素的配體E08 ; 圖3為本發(fā)明中Dot Blot法對核酸適配體Ε08的特異性分析，圖中：1 :空白對照(瘦肉 精+脫脂奶）；2 :空白對照(瘦肉精+不含配體的生物素）;3 :陰性對照(蘇丹紅+標(biāo)記有生 物素的配體E08) ;4 :陰性對照（α -鵝膏毒肽+標(biāo)記有生物素的配體E08) ;5 :陰性對照(草 甘膦+標(biāo)記有生物素的配體Ε08) ;6 :陰性對照(三聚氰胺+標(biāo)記有生物素的配體Ε08) ;7 : 陰性對照（乙型腦炎NSl蛋白+標(biāo)記有生物素的配體Ε08) ;8 :陰性對照（乙型腦炎core蛋 白+標(biāo)記有生物素的配體E08) ;9 :瘦肉精40 ng/ μ L +標(biāo)記有生物素的配體E08 ; 圖4為本發(fā)明中ELONA法對核酸適配體Ε08的最佳濃度的分析，圖中：空白對照1 :瘦 肉精+脫脂奶；空白對照2 :瘦肉精+不含配體的生物素；配體Ε08 :瘦肉精+標(biāo)記有生物素 的配體Ε08 ; 圖5為本發(fā)明中ELONA法對瘦肉精靈敏度的分析，圖中：空白對照：瘦肉精+脫脂奶； 配體Ε08 :瘦肉精+標(biāo)記有生物素的配體Ε08。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，實(shí)施例僅為了更好理 解本發(fā)明但不局限與本發(fā)明范圍，實(shí)施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，使用的試劑 如無特殊說明均為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0011] 實(shí)施例1:瘦肉精核酸適配體（Ε08)的篩選 一、配基(瘦肉精）與基質(zhì)(瓊脂糖凝膠6Β)的偶聯(lián) 1、在3 mL蒸餾水中懸浮I g的凍干粉末瓊脂糖凝膠6Β (I g凍干的粉末能夠產(chǎn)生出 大約3. 0 mL的最終的基質(zhì)體積）； 2、立即在燒結(jié)玻璃濾器中（多空度G3)用大約每克粉末200 mL的蒸餾水沖洗1小時(shí)； 3、 用6 mL的偶聯(lián)緩沖溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)溶解6 g的配基，使其最 終濃度為I mg/mL，或者用脫鹽柱將溶解的配基轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)緩沖溶液中，調(diào)整水相的pH值； 4、 將基質(zhì)與上述步驟3中的濃度為I mg/mL溶解好配基的緩沖溶液的比例調(diào)整為體積 比1:2,在25°C到40°C的水浴條件下，混合16 h，并且37°C搖床過夜； 5、 在40°C到50°C的條件下，用IM的氨基乙醇封閉過剩的基團(tuán)，至少4 h或者過夜； 6、 用偶聯(lián)緩沖液洗過剩的配基，4000 rpm離心2 min，吸取上清；用超純水(每次7-8 mL)清洗3次；緊接著用0.1 M NaHCO3,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0.1 M醋酸鹽，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用質(zhì)量百分比濃度為20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，豎直放置。
[0012] 二、核酸適配體文庫（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA適配體文庫； 1、 94°C 預(yù)熱 PCR 儀； 2、 將 3 yL ssDNA、30.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP 混合物(各2.5 μΜ)、2μL正向擴(kuò)增引物、2 yL反向擴(kuò)增引物以及0.4 yL Taq酶離心管 進(jìn)行反應(yīng)。正向擴(kuò)增引物序列為5 ' - GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '，反向擴(kuò)增引物序列為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0013] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增 (1) 預(yù)變性 94 0C 5分鐘； (2) 40個循環(huán) 94 0C 45秒鐘 58 0C 45秒鐘 72 0C 30 秒鐘； (3) 后擴(kuò)增 72 0C 7分鐘。
[0014] 三、配體庫的純化、上樣及洗脫 1、配體庫的純化 (1) 核酸適配體文庫PCR產(chǎn)物直接與膠回收試劑盒里的溶液按體積比1:1比例混合，進(jìn) 行DNA片段回收； (2) DNA片段回收后，95°C水浴lOmin，冰浴IOmin ;經(jīng)過此變性處理，使雙鏈DNA變成單 鏈 DNA。
[0015] 2、親和層析 (1) 用偶聯(lián)緩沖液洗脫偶聯(lián)過的基質(zhì)：先吸取上層酒精，加偶聯(lián)緩沖液至6 mL，混勻， 離心，棄去上清液，此步驟重復(fù)3次； (2) 將上述第1步中的單鏈DNA加入到偶聯(lián)過的基質(zhì)中，于37°C溫育并40 rpm輕柔轉(zhuǎn) 動2 h ; (3) 加入前述樣品到層析柱中，用2-3柱體積的超純水沖洗柱子； (4) 然后用3-4柱體積的洗脫緩沖液（0.1 M NaCl，0.1 M醋酸鹽，pH 4.0)進(jìn)行線性梯 度洗脫，收集洗脫組分； (5) 洗脫組分與膠溶液等體積混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
[0016] 四、PCR優(yōu)化和大量擴(kuò)增核酸適配體 以上述selex溶液作為模板，按如下步驟操作： 1、 94°C 預(yù)熱 PCR 儀； 2、 將5 yL 模板、28.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP混 合物(各2.5uM)、2 yL正向擴(kuò)增引物、2 yL反向擴(kuò)增引物、0.4 yLTaq酶，于PCR離心 管中進(jìn)行反應(yīng)。正向擴(kuò)增引物序列為5' -GACATATTCAGTCTGACAGC-3'，反向擴(kuò)增引物序列 為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0017] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增： (1) 預(yù)變性 94 0C 5分鐘； (2) 37個循環(huán)： 94 0C 45秒鐘 58 0C 45秒鐘 72 0C 30 秒鐘； (3)后擴(kuò)增 72 °C 7分鐘； 4、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行抽提回收，步 驟如下： (1) 將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室 溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液； (2) 加入700 μL的漂洗液(含乙醇）于離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液； (3) 重復(fù)步驟（2); (4) 12000 rpm 離心 3 分鐘； (5) 將離心純化柱置于新的離心管中； (6) 加入30 PL超純水，在室溫下靜置5分鐘； (7) 12000 rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過的核酸適配體的PCR產(chǎn)物。
[0018] 實(shí)施例2:核酸適配體的克