OmM MgC12的MS(豆柏粉2%、甘露醇2%、瓊脂2% )平板上，28°C 培養(yǎng)16~20h后，用ImL含1000 μ g萘啶酮酸和1000 μ g安普霉素的無菌水均勻覆蓋，在 28°C培養(yǎng)5~7天，長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗性傳代培養(yǎng)及PCR驗(yàn)證正確后，進(jìn) 行下一步的發(fā)酵研究。
[0056] 實(shí)施例3、重組菌株的發(fā)酵研究
[0057] 1、阿維鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵
[0058] 阿維鏈霉菌出發(fā)菌株阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis MA4680及其抗性 篩選成功的重組菌在斜面培養(yǎng)基上長(zhǎng)出豐富的孢子后，對(duì)阿維鏈霉菌轉(zhuǎn)化子的番茄紅素產(chǎn) 量水平進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，使用轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pIJ8660-RiboJ-crtEIB的重組阿維鏈 霉菌 SAV-RiboJ-crtEIB 作為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pIJ866〇-Promoters-RiboJ_crtEIB 的重組阿維鏈 霉菌SAV-Promoters-RiboJ-crtEIB的陰性對(duì)照，使用轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pIJ8660_crtEIB的重組阿 維鏈霉菌SAV-crtEIB作為轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒pIJ866〇-Promoters_crtEIB的重組阿維鏈霉菌 SAV-Promoters-crtEIB陰性對(duì)照，見表2。挖取斜面菌苔lcm2,將待測(cè)菌株接入裝有25mL滅 過菌的種子培養(yǎng)基的種子瓶，30°C搖床培養(yǎng)44~48小時(shí)，轉(zhuǎn)速220rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm， 得到種子培養(yǎng)液。取上述種子培養(yǎng)液按2% (體積百分比）的接種量接種于裝有50mL滅 過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C搖床培養(yǎng)5天，每個(gè)樣品取2份5mL發(fā)酵液離心收集菌 體，用無菌水清洗兩邊，一份用于凍干，計(jì)算干重，一份經(jīng)10mg/mL溶菌酶處理3h后，加入 IOOyL二甲基亞砜和400 yL丙酮，充分震蕩懸浮菌體后，加入ImL二氯甲燒，充分震蕩后超 聲10min，離心取上清，若萃取不徹底，需重復(fù)幾次，至菌體無可見的紅色為止，萃取物定量 后，用0. 2 μ m的微孔濾膜過濾，獲得濾液進(jìn)行HPLC (Agilent 1200高效液相色譜儀）分析， 測(cè)定番茄紅素的發(fā)酵產(chǎn)物濃度，具體HPLC分析如下述步驟2所述。
[0059] 本實(shí)驗(yàn)中的固體培養(yǎng)基（豆柏粉2%、甘露醇2%、瓊脂2% )，種子培養(yǎng)基（葡 萄糖0. 5%，豆餅粉1. 5%，酵母提取物0. 5%，pH 7. 2)，發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖60g/ L, (NH4)2SO4 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. lg/L, K2HPO4 0. 5g/L, NaCl 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05g/ L, ZnSO4 · 7H20 0· 05g/L, MnSO4 · 4H20 0· 05g/L, CaCO3 5g/L,酵母提取物 2g/L，pH 7. 0。
[0060] 2、發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析
[0061] HPLC 分析使用 Agilent 1200 series HPLC system(Agilent Technologies Sales&Services GmbH&Co.，KG，Waldbronn)，番前紅素的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，樣品米用等度 洗脫方式：使用 ZORBAX SB-C18 色譜柱（150_X4.6mm，Agilent)。洗脫液為 30% (vol/ vol)乙腈/甲醇，洗脫時(shí)間為35分鐘，進(jìn)樣量為50 μ L，流速為lmL/min，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品 (aladdin, Shanghai, China)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。
[0062] 上述阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis MA4680的系列菌株的發(fā)酵結(jié) 果見表1，其中，Control在SAV-Promoters-crtEIB系列重組菌中為SAV-crtEIB，在 SAV-Promoters-RiboJ-crtEIB 系列重組菌中為 SAV-RiboJ-crtEIB，產(chǎn)量無法用 HPLC 觀察 至丨J，這也證實(shí)了在Streptomyces avermitilis MA4680中番前紅素的基因是沉默存在的。 其中啟動(dòng)子的強(qiáng)度水平是基于實(shí)驗(yàn)室前人的研究和驗(yàn)證的啟動(dòng)子理論強(qiáng)度水平，以kasOp* 為100 %強(qiáng)度衡量。
[0063] 從圖4的發(fā)酵結(jié)果可以看到，不同人工合成啟動(dòng)子的使用，番茄紅素的產(chǎn)量逐 步提升，但在不加入絕緣元件RiboJ時(shí)，啟動(dòng)子水平高于50% kasOp*時(shí)就出現(xiàn)了產(chǎn)量 水平的下降，在啟動(dòng)子達(dá)到kasOp*理論強(qiáng)度時(shí)就已觀察不到番茄紅素的產(chǎn)量，這可能 正是表達(dá)元件之間的干擾形成的，在啟動(dòng)子和RBS區(qū)加入絕緣元件RiboJ時(shí)，番茄紅素 的產(chǎn)量隨著啟動(dòng)子理論強(qiáng)度的增加在逐漸增長(zhǎng)，這提示我們這一人工表達(dá)元件系統(tǒng)在 加入RiboJ后，具有更好的可預(yù)測(cè)性。其中啟動(dòng)子SP44和絕緣元件RiboJ聯(lián)合使用，以 阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis MA4680)為出發(fā)菌株，得到的重組阿維鏈霉菌 SAV-SP44-RiboJ-crtEIB，在搖瓶培養(yǎng)120小時(shí)后，番茄紅素素產(chǎn)量可達(dá)到82. 02±8. 69mg/ g DCW0
[0064] 表1 :不同啟動(dòng)子和絕緣元件在阿維鏈霉菌重組菌株中過表達(dá)番茄紅素產(chǎn)量
[0066] 表2 :本發(fā)明中所使用的菌株和質(zhì)粒材料

CN 105176899 A I兄明 9/9 頁
[0070] 最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并 非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做 出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引 申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 選擇出發(fā)菌株和目的基因； (2) 構(gòu)建包含所述目的基因的表達(dá)載體； (3) 在步驟（2)中所述目的基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之前插入有絕緣子功能的序列，并 且在所述有絕緣子功能的序列之前插入有異源或人工合成啟動(dòng)子序列； (4) 將步驟（3)中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)菌。2. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述出發(fā)菌包括野生型或經(jīng)基因工程 改造的原核微生物；優(yōu)選地，包括大腸桿菌、鏈霉菌和放線菌。3. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述鏈霉菌包括野生型鏈霉菌或 經(jīng)修飾、突變、誘變或基因重組獲得的鏈霉菌；優(yōu)選地，所述鏈霉菌為St^ptomyces avermitilisMA4680。4. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述目的基因包括原核生物基因組編 碼的基因，真核生物cDNA中編碼的基因。5. 如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述原核生物基因組編碼的基因包括 在鏈霉菌中編碼的基因；優(yōu)選地，包括crtE基因、crtl基因和crtB基因。6. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述異源或人工合成啟動(dòng)子包括經(jīng)修 飾改造的原啟動(dòng)子序列、所述出發(fā)菌中其他基因啟動(dòng)子序列、異源菌株中的啟動(dòng)子序列或 經(jīng)人工合成的啟動(dòng)子序列；優(yōu)選地，包括SP12、SP18、SP23、SP26、kas0p*、SP43或SP44啟動(dòng) 子。7. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述有絕緣子功能的序列是在轉(zhuǎn)錄形 成RNA后具有5'端剪切的核酶功能，并通過切除所述有絕緣子功能的序列前的序列，減弱 核糖體結(jié)合序列所受干擾并且轉(zhuǎn)錄后形成RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；優(yōu)選地，包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ或PlmvJ序列。8. 如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2)中采用整合型質(zhì)粒載體表達(dá)所 述目的基因。9. 如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述整合型表達(dá)載體為大腸桿菌-鏈霉 菌穿梭載體PIJ8660。10. -種高產(chǎn)目的基因的重組菌，其特征在于，所述重組菌中具有包含目的基因的表達(dá) 載體，所述目的基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之前插入有絕緣子功能的序列，并且在所述有絕緣 子功能的序列之前插入有異源或人工合成啟動(dòng)子。11. 如權(quán)利要求10所述的重組菌，其特征在于，所述目的基因?yàn)榘珻rtE基因、crtl 基因和crtB基因的基因簇。12. 如權(quán)利要求11所述的重組菌，其特征在于，所述異源或人工合成啟動(dòng)子包括經(jīng)修 飾改造的原啟動(dòng)子序列、出發(fā)菌株中其他基因啟動(dòng)子序列、異源菌株中的啟動(dòng)子序列或經(jīng) 人工合成的啟動(dòng)子序列；優(yōu)選地，包括SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44啟動(dòng) 子。13. 如權(quán)利要求11所述的重組菌，其特征在于，所述有絕緣子功能的序列是在轉(zhuǎn)錄形 成RNA后具有5'端剪切的核酶功能，并通過切除所述有絕緣子功能的序列前的序列，減弱 核糖體結(jié)合序列所受干擾并且轉(zhuǎn)錄后形成RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；優(yōu)選地，包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ 或 PlmvJ 序列。14. 如權(quán)利要求11所述的重組菌，其特征在于，所述包含目的基因的表達(dá)為整合型質(zhì) 粒載體表達(dá)載體。15. 如權(quán)利要求14所述的重組菌，其特征在于，所述整合型質(zhì)粒表達(dá)載體為大腸桿 菌-鏈霉菌穿梭載體PIJ8660。16. 如權(quán)利要求11所述的重組菌，其特征在于，構(gòu)建所述重組菌使用的出發(fā)菌包括野 生型或經(jīng)基因工程改造的原核微生物；優(yōu)選地，包括大腸桿菌、放線菌和鏈霉菌。17. 如權(quán)利要求16所述的重組菌，其特征在于，所述鏈霉菌包括野生型鏈霉菌或經(jīng)修 飾、突變、誘變或基因重組獲得的鏈霉菌；優(yōu)選地，所述鏈霉菌為阿維鏈霉菌St^ptomy ces avermitilis MA4680。18. -種發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求11至17中任一所述的 重組菌進(jìn)行發(fā)酵。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的方法，包括如下步驟：(1)選擇出發(fā)菌株和目的基因；(2)構(gòu)建包含所述目的基因的表達(dá)載體；(3)在步驟(2)中所述目的基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之前插入有絕緣子功能的序列，并且在所述有絕緣子功能的序列之前插入有異源或人工合成啟動(dòng)子序列；(4)將步驟(3)中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)菌。還涉及根據(jù)以上方法構(gòu)建的重組菌及利用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的方法。
【IPC分類】C12P5/02, C12R1/465, C12N15/76, C12N1/21
【公開號(hào)】CN105176899
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張立新, 胡逸靈, 婁春波, 白超弦, 苗靳, 向四海, 黃佩
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院微生物研究所, 安徽大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月14日