花盆中，壓實(shí)。棉花品種選用冀 豐106,播種前應(yīng)用實(shí)施例1制備的HMB27756液體制劑50倍水稀釋液浸種半小時(shí)；以清水 浸種半小時(shí)作為空白對(duì)照。浸種處理后每盆播種10粒種子，覆蓋滅菌土壤，正常培養(yǎng)。出 苗后20天調(diào)查每棵苗的發(fā)病級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。
[0077] 結(jié)果（見(jiàn)表2)當(dāng)空白對(duì)照棉花立枯病病情指數(shù)為64. 42時(shí)，解淀粉芽孢桿菌 HMB27756浸種處理的病情指數(shù)為19. 44,其防治棉花立枯病的效果可達(dá)69. 82%。說(shuō)明本發(fā) 明解淀粉芽孢桿菌HMB27756及其微生物菌劑對(duì)棉花立枯病具有很好的防治效果。
[0078] 表2解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)棉花立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果
[0080] 實(shí)施例4解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)番茄立枯病的防治效果試驗(yàn)
[0081] ( -）試驗(yàn)處理：
[0082] (1)微生物菌劑：實(shí)施例1制備的HMB27756液體制劑；按照I : 1比例添加碳酸鈣， 制備HMB27756粉劑。
[0083] (2)空白對(duì)照：未處理。
[0084] (二）試驗(yàn)方法：
[0085] 本試驗(yàn)在河北省保定市徐水縣白塔鋪村賈書(shū)義大棚開(kāi)展。將實(shí)施例1制備的 HMB27756液體制劑按照1 :1比例添加碳酸鈣，制備HMB27756粉劑。番茄移栽前，每穴穴施 HMB27756粉劑1克，然后栽苗，以未處理為空白對(duì)照。每重復(fù)5行番茄，重復(fù)4次。試驗(yàn)共 用番茄40行。統(tǒng)一施肥澆水管理。待空白對(duì)照番茄立枯病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)調(diào)查發(fā)病率并計(jì)算 防治效果。
[0086] 結(jié)果（見(jiàn)表3)當(dāng)空白對(duì)照番茄立枯病發(fā)病率為82. 27 %時(shí)，解淀粉芽孢桿菌 HMB27756穴施處理的發(fā)病率僅為12. 5%，其防治番茄立枯病的效果可達(dá)82. 27%。說(shuō)明本 發(fā)明解淀粉芽孢桿菌HMB27756及其微生物菌劑對(duì)番茄立枯病具有很好的防治效果。
[0087] 表3解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)番茄立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果
[0088] CN 105176893 A 說(shuō)明書(shū) 7/8 頁(yè)
[0089] 實(shí)施例5解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)黃瓜立枯病的防治效果試驗(yàn)
[0090] (一）試驗(yàn)處理：
[0091 ] (1)微生物菌劑：實(shí)施例1制備的HMB27756液體制劑；按照I : 1比例添加碳酸鈣， 制備HMB27756粉劑。
[0092] (2)空白對(duì)照：未處理。
[0093] (二）試驗(yàn)方法：
[0094] 本試驗(yàn)在河北省保定市定興縣久安莊村王洪義大棚開(kāi)展。將實(shí)施例1制備的 HMB27756液體制劑按照1 :1比例添加碳酸鈣，制備HMB27756粉劑。黃瓜移栽前，每穴穴施 HMB27756粉劑1克，然后栽苗，以未處理為空白對(duì)照。每重復(fù)6行黃瓜，重復(fù)4次。試驗(yàn)共 用黃瓜48行。統(tǒng)一施肥澆水管理。待空白對(duì)照黃瓜立枯病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)調(diào)查發(fā)病率并計(jì)算 防治效果。
[0095] 結(jié)果（見(jiàn)表4)當(dāng)空白對(duì)照黃瓜立枯病發(fā)病率為42. 5 %時(shí)，解淀粉芽孢桿菌 HMB27756穴施處理的發(fā)病率為僅4. 0%，其防治黃瓜立枯病的效果可達(dá)90. 58%。說(shuō)明本發(fā) 明解淀粉芽孢桿菌HMB27756及其微生物菌劑對(duì)黃瓜立枯病具有非常好的防治效果。
[0096] 表4解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)黃瓜立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果
[0098] 實(shí)施例6解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)三種重要病害病原菌的抑制作用
[0099] (一）試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)：2015年5月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
[0100](二）試驗(yàn)方法：
[0101] (1)供試病害病原真菌來(lái)源：棉花黃萎菌WX-I分離自河北省邢臺(tái)市威縣棉花黃 萎病病株，棉花枯萎菌F0V-1分離自河北省邯鄲市曲周縣棉花枯萎病病株，番茄灰霉菌 BC-I分離自河北省保定市徐水縣番茄灰霉病病果，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理 系鑒定分別為大麗輪枝菌（Verticillium dahaliae)、尖孢鐮刀菌棉花?；停‵usarium oxyporium f.sp.vasinfectum)和灰葡萄抱菌（Botrytis cinerea)，致病力測(cè)定均表現(xiàn)為 強(qiáng)致病力。
[0102] (2)平板測(cè)定試驗(yàn)：
[0103] 首先將供試的病原真菌在PDA平板上活化，培養(yǎng)3-7天后在菌落邊緣區(qū)域，用打孔 器（0=6mm)打孔制成菌片，將供試病原真菌菌片轉(zhuǎn)接在另一個(gè)PDA平板中央，再將實(shí)施 例1步驟（1)活化的解淀粉芽孢桿菌HMB27756點(diǎn)接在距指示菌菌片2. 0厘米處，設(shè)空白對(duì) 照（不點(diǎn)接HMB27756菌株的供試病原真菌的生長(zhǎng)情況）。25°C恒溫培養(yǎng)3-7天，逐日觀察 HMB27756菌株和供試病原真菌的生長(zhǎng)情況，待對(duì)照病原菌長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，觀察并記錄 對(duì)照病原菌生長(zhǎng)的半徑，抑菌帶寬度。用"+++"表示HMB27756菌株抑菌作用很強(qiáng)，抑菌帶寬 度大于9. Omm ;用"++"表示HMB27756菌株抑菌作用為中等強(qiáng)度，抑菌帶寬度為3. 0-9. Omm ; 用" + "表示HMB27756菌株抑菌活性較弱，抑菌帶寬度小于3. 0mm。
[0104] 結(jié)果（見(jiàn)表5)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌HMB27756對(duì)番茄灰霉菌具有很強(qiáng)的抑制作 用，對(duì)棉花黃萎菌和枯萎菌也具有中等強(qiáng)度的抑制作用。具有防治供試三種重要病害的生 防潛力。
[0105] 表5 HMB27756菌株對(duì)三種重要病原真菌的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種解淀粉芽抱桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27756，己于 2015 年9月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.11459。2. 利用權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌HMB27756生產(chǎn)的微生物菌劑，其特征在于其 活性成分為解淀粉芽孢桿菌HMB27756菌體。3. 權(quán)利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將低溫保存的HMB27756菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng) 基上、在25~35°C下培養(yǎng)10~16小時(shí)，得活化的菌株； (2) 用無(wú)菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟（1)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在 25~35°C、轉(zhuǎn)速為150~220rpm的條件下培養(yǎng)10~16小時(shí)，得種子液； (3) 按照體積比為1~3%的比例將步驟（2)的種子液接入到玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基中， 在溫度為25~35°C、搖床轉(zhuǎn)速為150~220rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)40~50h，得發(fā)酵液； (4) 檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和芽胞數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數(shù)的90% 時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB27756菌株的液體制劑。4. 按照權(quán)利要求3所述的制備方法。其特征在于其步驟（1)中所述的LB平板培養(yǎng)基 或LB斜面培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉 4~6g，瓊脂粉12~18g，水1000 mL;其步驟（2)所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其重 量比為：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉4~6g，水1000mL。5. 按照權(quán)利要求3所述的制備方法。其特征在于其步驟（3)所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng) 基的組成成分及其重量百分比為：玉米粉1. 0~3. 0%，黃豆粉1. 0~3. 0%，NaCl0. 1~ 0? 8%，MnS04 ?H2O0? 5 ~L0%，其余為水；pH值為 7. 0。6. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌HMB27756在防治作物立枯病上的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的微生物菌劑在防治作物立枯病上的應(yīng)用。8. 按照權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于其所述的作物是指棉花、番茄或黃瓜。9. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27756的鑒定方法，其特征在于以待測(cè)菌 株的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即為HMB27756菌株。10. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27688的鑒定方法，其特征在于以待測(cè) 菌株的基因組DNA為模板，以gyrB-F和gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物為SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即為HMB27756菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了屬于生物防治領(lǐng)域的一種用于防治作物立枯病的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus？amyloliquefaciens)菌株HMB27756，其保藏編號(hào)為CGMCC？No.11459。本發(fā)明還公開(kāi)了含有該菌株菌體的微生物菌劑，以及它們?cè)诜乐巫魑锪⒖莶∩系膽?yīng)用。本發(fā)明為防治作物立枯病提供了一個(gè)高效的微生物，平均防效在80.0％以上，且針對(duì)性強(qiáng)；其次，本發(fā)明微生物菌劑對(duì)人、畜安全，屬于環(huán)境友好型；此外，利用本發(fā)明防治棉花立枯病不易產(chǎn)生抗藥性；本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡(jiǎn)單、成本低、使用簡(jiǎn)單。CGMCC No. 1145920150929
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/07, A01N63/00, C12Q1/04, C12Q1/68, A01P3/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105176893
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李社增, 鹿秀云, 郭慶港, 張曉云
【申請(qǐng)人】保定微控生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年11月3日