一種用于防治作物立枯病的解淀粉芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農業(yè)微生物領域，具體涉及一種用于防治作物立枯病的解淀粉芽孢桿 菌，以及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還涉及它們在防治作物立枯病上的應用。
【背景技術】
[0002] 由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani KUhn)引起的棉花、番前、黃瓜等作物苗期立 枯病嚴重影響作物的正常生長，甚至造成缺苗斷壟。低溫多雨年份作物立枯病發(fā)生尤為嚴 重。
[0003] 作物立枯病的防治方法主要以化學藥劑拌種或包衣防治為主，但防效欠佳，而且 存在環(huán)境污染問題，不符合農業(yè)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的需要。其次，由于缺乏有效的抗病基因， 還未發(fā)現(xiàn)抗立枯病的棉花、番茄和黃瓜品種。因此生產(chǎn)上對作物立枯病仍缺乏有效、環(huán)保的 防治措施。此外，生物防治方法由于具有藥效高、?；詮?、持續(xù)有效期長、不易產(chǎn)生抗藥性 和生產(chǎn)簡單、成本低等優(yōu)點，日益受到重要。利用活體微生物農藥是防治作物土傳病害行之 有效的措施，而篩選有效防治作物立枯病的生防細菌是開發(fā)微生物源農藥的基礎。
[0004] 芽孢桿菌（Bacillius sp)是一種受到廣泛關注的生防細菌。以其分布廣、易分 離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強的芽胞、貯藏期長和使用方便等特點，成為一種理想的生防微生 物。因芽孢桿菌能產(chǎn)生內生芽胞，有極強的抗逆能力，相比其他類型的生防因子，更有利于 菌劑的生產(chǎn)，在劑型加工環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽 孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。
[0005]目前，用于防治作物立枯病的芽孢桿菌主要有：解淀粉芽孢桿菌SZ - 60 (【申請?zhí)枴?2014100170816)、枯草芽孢桿菌G68(【申請?zhí)枴?014102479010)、枯草芽孢桿菌DPPG-26(申 請?zhí)枺?014103868726)、萎縮芽孢桿菌DPPG-28 (2014104612134)、多粘類芽孢桿菌 HY96-2 (專利號：021510199)、枯草芽孢桿菌HL259 (專利號：2005101048723)、枯草芽孢桿 菌B579 (專利號：2008101531801)、枯草芽孢桿菌NJN43 (專利號：2009101833581)、枯草芽 孢桿菌NB12(專利號：2011104234353)和巨大芽孢桿菌SJ-7(專利號：2013102557034)等。 由于病原菌的多樣性和同步進化，因此需要不斷尋找新的菌株。
[0006] 經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)有關本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27756的報道。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種用于防治作物立枯病的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株具 有高效、殺菌譜廣等優(yōu)點。
[0008] 本發(fā)明另一目的在于提供利用上述解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑。
[0009] 本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。
[0010] 本發(fā)明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在防治作物立枯病上的用途。
[0011] 本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治作物立枯病上的用途。
[0012] 本發(fā)明第六目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌的鑒定方法。
[0013] 本發(fā)明第七目的在于提供上述微生物菌劑的鑒定方法。
[0014] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0015] 一種解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 HMB27756,己于 2015 年9月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏地址為：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCC No. 11459。
[0016] 利用上述解淀粉芽孢桿菌HMB27756生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為解淀粉芽 孢桿菌HMB27756菌體。
[0017] 上述微生物菌劑可以為液體制劑或粉劑。
[0018] 上述微生物菌劑，其所含解淀粉芽孢桿菌HMB27756的活菌數(shù)大于12. OX IO8Cfu/ mL〇
[0019] 上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0020] (1)菌種活化：將低溫保存的HMB27756菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落 在LB斜面培養(yǎng)基上、在25~35°C下培養(yǎng)10~16小時，得活化的菌株；
[0021] (2)種子液制備：用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟（1)活化的菌株接種到IOOmL LB 液體培養(yǎng)基中，在25~35°C、轉速為150~220rpm的條件下培養(yǎng)10~16小時，得種子液；
[0022] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為1~3%的比例將步驟⑵的種子液接入到玉米粉 黃豆粉培養(yǎng)基中，在溫度為25~35°C、搖床轉速為150~220rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)40~ 50h，得發(fā)酵液；
[0023] (4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽胞數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數(shù)的 90%時停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為腿827756菌株的液體制劑。
[0024] 上述制備方法中所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常 規(guī)方法制備。
[0025] 上述制備方法步驟（1)中所述的LB平板培養(yǎng)基或LB斜面培養(yǎng)基，其組成成分及 其重量比為：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉4~6g，瓊脂粉12~18g，水 1000 mL0
[0026] 上述制備方法步驟（2)所述的LB液體培養(yǎng)基，其組成成分及其重量比為：胰蛋白 胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉4~6g，水1000mL。
[0027] 上述制備方法步驟（3)所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比 為：玉米粉1.0~3.0%，黃豆粉1.0~3.0%，恥(：10.1~0.8%，]\111504.!120 0.5 ~1.0%， 其余為水；PH值為7.0。
[0028] 所述玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和 MnSO4 · H2O混合，再加水，調節(jié)pH攪拌均勾即可。
[0029] 所述的解淀粉芽孢桿菌HMB27756在防治作物立枯病上的應用。
[0030] 上述微生物菌劑在防治作物立枯病上的應用。
[0031] 上述應用中所述的作物是指棉花、番茄或黃瓜等。
[0032] 上述微生物菌劑的使用方法：將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌體數(shù)為 10scfu/mL，于棉花播種前將種子浸種半小時；或將上述所得微生物菌劑用碳酸鈣吸附，制 作成解淀粉芽孢桿菌HMB27756粉劑，于番茄、黃瓜移栽時按照1棵苗1克粉劑的用量穴施， 均可達到預防棉花、番茄、黃瓜等作物立枯病發(fā)生的目的。
[0033] HMB27756菌株的篩選分離過程：
[0034] HMB27756菌株是從西藏自治區(qū)浪卡子洋湖濕地土壤中分離得到。2013年6月從 西藏自治區(qū)浪卡子洋湖濕地中采集土樣，帶回實驗室后稱取5g 土樣放到250mL的滅菌三 角瓶中，加入IOOmL無菌水，放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液IOmL加 入50mL滅菌離心管中，在80°C恒溫水浴30分鐘，然后取ImL加無菌水9mL，即成IOmLlO 3倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10 4、10 5、10 6倍稀釋液，取各濃度微生物懸液 200 μ L涂于LB培養(yǎng)基平板上，每個濃度重復3次，在30°C恒溫培養(yǎng)ld-3d，進行細菌的分離 和純化。并以棉花立枯病、番茄立枯病、黃瓜立枯病為靶標，通過平板對峙法、盆栽試驗法或 田間小區(qū)試驗進行生防菌的篩選。結果從中篩選出一個對棉花立枯病具有明顯防治效果的 菌株，定名為HMB27756。
[0035] HMB27756菌株的分類鑒定：
[0036] (1)形態(tài)特征鑒定
[0037] 在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)IOh后產(chǎn)生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不 膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運動，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡 乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣 不整齊，表面干燥有褶皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培 養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠等編著.科學 出版社.2001年）中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB27756屬于芽 孢桿菌屬。
[0038] (2)利用16S rDNA序列鑒定分類
[0039] 以HMB27756的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進行PCR 擴增，所述的引物序列為：
[0040] F27 :5, AGAGTTTGATCATGGCTCAG3, ；（SEQ ID No. 1)
[0041] R1492 :5' GGCTACCTTGTTACGACTT3' ；（SEQ ID No. 2)
[0042] 16S rDNA 的擴增反應體系為 50yL:10XPCR Buffer(Mg2+)5yL ;dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L ;Taq(5U/μ L)1 μ L，F(xiàn)27(10 μ mol/L) 1 μ L，R1492(10 μ mol/L) 1 μ L ; HMB27756 的基因組 DNA 50ng ;