C-2 和 C-3 ;0H-15 與 C-4 和 C-14 的 相關(guān)性，以及結(jié)合這些質(zhì)子和共振碳的化學(xué)位移，表明該化合物C-2, C-3和C-15位分別連 有甲基、肉桂酸酯片段和羥基。通過HMBC譜中H-4與C-5和C-6 ;H-5與C-3, C-4, C-6和 C-17 ;H3-17 與 C-5, C-6 和 C-13 ;H3-20 與 C-6, C-13 和 C-14 ;0H-5 與 C-4, C-5 和 C-6 ;0H-15 與C-14的相關(guān)性，可知環(huán)己酮環(huán)通過C-4和C-15與五元環(huán)相連，且C-5位連有一個羥基， C-6和C-13位分別連有一個叔甲基。此外，H-9和H-Il與C-18和C-19 ;H-11與C-12和 C-13 ;H-12 與 C-13 和 C-20 ;H3-17 與 C-7 ;H3-18 和 H3-19 與 C-9, C-IO 和 C-Il ;H3-20 與 C-12 ;0H-9與C-9和C-IO的相關(guān)性表明該化合物含有一個八元環(huán)，通過C-6和C-13與六 元環(huán)相連，C-9、C-ll，C-12位各連有一個羥基，C-IO位連有兩個甲基。NOESY譜中，H-5與 H-12和OH-15 ;H-12與H3-19的相關(guān)性表明它們?yōu)镻構(gòu)型。此外，H-3與H-2，H-4和0H-5 ; H-4與H-2, H-3和H3-17 ;H-9與H-Il和H3-18的相關(guān)性表明這些質(zhì)子為a構(gòu)型。綜合氫 譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1 所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖2)。
[0028] 實施例2 :化合物（I )藥理作用試驗
[0029] 一、材料和儀器
[0030] IfepG2人肝癌細(xì)胞株購自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。L02正常人肝細(xì) 胞株由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所饋贈?；衔铮↖ )自制，HPLC歸一化純度大于98%。 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司。標(biāo)準(zhǔn)小牛血清購自Biowest公司。3-(4, 5-二甲 基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT)、二甲基亞砜（DMSO)、臺盼藍(lán)（TrypanBLue)、二氯 熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA)均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他常用試劑均為分 析純。
[0031] 微量天平（瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通臺式離心機(jī)（上海 安亭科學(xué)儀器廠）。數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠，HH. W21.600S)。二氧 化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國FormaScientific公司）。高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司， IECMICROMAXRF)。超微量紫外分光光度計（美國 ThermoHsher 公司，NanoDrop-1000)。 紫外成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司，F(xiàn)R-200A)。酶聯(lián)免疫檢測儀，熒光分光光度計 (HitachiF2500)。
[0032] 二、試驗方法
[0033] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0034] 將細(xì)胞常規(guī)接種于含10% (體積分?jǐn)?shù)）小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% 0)2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035] 2、化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液的配置
[0036] 將45. 44mg化合物（I )溶于IOmL二甲基亞砜（DMSO)制得儲備液并分別稀釋2 倍、4倍，分別得到2mmol/L、4mmol/L及8mmol/L的化合物（I )應(yīng)用液。進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)前， 將50 y L應(yīng)用液與4950 y L常規(guī)培養(yǎng)液（含10 %體積分?jǐn)?shù)的小牛血清）充分混合，得到化 合物（I )干預(yù)培養(yǎng)液（20limcil/L、40iimcil/L、80iimcil/L)〇
[0037] 3、MTT法檢測細(xì)胞存活率
[0038] 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 y L (5 X IO3細(xì)胞）。培養(yǎng)12h待 細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200 y L不同濃度的化合物（I )培養(yǎng)液（DMS0溶解化合物 (I )后以1%體積分?jǐn)?shù)與常規(guī)培養(yǎng)液混合，使化合物（I )終濃度為20ymol/L、40ymol/ L、80ymol/L)，每組6個平行孔。同時設(shè)6個溶劑（DMSO)對照孔。培養(yǎng)2處、4811、7211，每 24小時更換化合物（I )干預(yù)培養(yǎng)液。干預(yù)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，向各孔加入20 y LMTT溶 液，37°C孵育4h后吸去各孔上清液，加入150 y L DMS0,置搖床上低速震蕩lOmin，待結(jié)晶充 分溶解后，以DMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度，計算細(xì)胞存活率 (survivalrate，SR)。SR =實驗組 A49。/ 對照組 A49qX 100%
[0039] 4、臺盼藍(lán)染色測定存活細(xì)胞數(shù)
[0040] 將相同數(shù)量（2X IO6)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細(xì)胞貼壁后，棄 去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩遍后，加入5mL的化合物（I )干預(yù)培養(yǎng)液（20ym〇l/L、40ym〇l/ L、80ymol/L)。每組三瓶細(xì)胞，同時設(shè)立三瓶溶劑（DMSO)對照。培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰 酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞數(shù)。
[0041] 5、DCFH-DA法測定細(xì)胞內(nèi)ROS活性
[0042] 將相同數(shù)量（2X106)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細(xì)胞貼壁后， 吸去原培養(yǎng)液，加入5mL化合物（I )干預(yù)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消 化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于I. 5mL EP管中，1500rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入ImL DCFH-DA，吹打混勻，37°C孵育30min，加入PBS終止反應(yīng)，離心收集沉淀并溶解于ImL PBS， 吹打成均勻細(xì)胞懸液，用Hitachi-F2500焚光分光光度計測定熒光值。激發(fā)波長488nm，發(fā) 射波長525nm。
[0043] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0044] 1、細(xì)胞生長存活率
[0045] IfepG2細(xì)胞經(jīng)化合物（I )干預(yù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，低、中、高劑量組的細(xì)胞存活 率均顯著低于溶劑對照組（P〈〇. 05)，且細(xì)胞存活率下降的程度與化合物（I )干預(yù)濃度之 間存在一定劑量效應(yīng)趨勢（表l，aP〈〇. 05VS對照組；bP〈0. 05VS低劑量組；T〈0. 05VS中劑量 組）。在同一化合物（I )干預(yù)濃度下，細(xì)胞存活率隨著干預(yù)時間的增加而呈現(xiàn)下降的趨 勢。而同等條件下，L02人正常肝細(xì)胞經(jīng)化合物（I )干預(yù)后，細(xì)胞存活率無顯著變化（表 2)。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與MTT -致（圖3, aP〈0. 05VS對照組；bP〈0. 05VS低劑量組； CP〈0. 05VS中劑量組）。
[0046] 2、細(xì)胞內(nèi)ROS活性
[0047] HepG2人肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度化合物（I )干預(yù)后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水 平顯著下降（p〈0. 05)。結(jié)果見表3 (aP〈0. 05VS對照組；bP〈0. 05VS低劑量組）。
[0048] 結(jié)論，采用不同濃度的化合物（I)對人肝癌細(xì)胞H印G2進(jìn)行干預(yù)處理，經(jīng)MTT比 色及臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)表明，化合物（I )能夠有效抑制H印G2細(xì)胞的生長增殖，干預(yù)組 細(xì)胞的存活率較對照組顯著降低，且降低程度與化合物（I )濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨 勢，同時在同一化合物（I )濃度下，細(xì)胞存活率隨著干預(yù)時間的增加而呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨 勢。與此同時，相同劑量的化合物（I )干預(yù)對L02正常肝細(xì)胞并不產(chǎn)生抑制作用。
[0049] 表1化合物（I)對IfepG2細(xì)胞生長存活率的影響（X土s，n=6)
[0050]
[0051] 表2化合物（I)對L02細(xì)胞生長存活率的影響（X土s，n=6)
[0052]
[0053] 表3化合物（I)對IfepG2細(xì)胞ROS水平的影響（X土s，n=6)
[0054]
[0055] 實施例3
[0056] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0057] 實施例4
[0058] 口服液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制 成口服液。
[0059] 實施例5
[0060] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0061] 實施例6
[0062] 注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0063] 實施例7
[0064] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌 熔封得粉針劑。
[0065] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I )，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 尾葉香茶菜的干燥全草粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10 %乙醇洗脫10個 柱體積，再用75 %乙醇洗脫12個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫 物浸膏；（c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、40:1、 20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分3用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到 3個組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~13個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I )。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為75 %。5. -種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I )和藥學(xué)上 可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療肝癌的新的雙萜化合物，屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及從尾葉香茶菜的干燥全草中分離得到的一種新的雙萜化合物、制備方法和該化合物的醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，可以從尾葉香茶菜的干燥全草中提取、分離純化得到，純度高。體外試驗證明該化合物能夠有效抑制HepG2細(xì)胞的生長增殖，且降低程度與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨勢，可以進(jìn)一步研究開發(fā)成治療肝癌的藥物。
【IPC分類】C07C67/48, C07C67/56, A61P35/00, A61K31/216, C07C69/618
【公開號】CN105175265
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】高忠青
【申請人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月19日