維水凝膠；從圖中可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，并長出較長的軸突，而在RADA 16-1水凝膠中則沒有任何軸突長出。
[0023]圖4為利用活死細(xì)胞檢測試劑盒檢測神經(jīng)干細(xì)胞在不同三維支架中的存活，綠色代表活細(xì)胞，紅色代表死細(xì)胞。A為本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠；B為RADA 16-1納米纖維水凝膠；從圖中可以看出神經(jīng)干細(xì)胞在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中大量存活，存活率達(dá)到100%，并可以三維生長，并長出較長的軸突，而在RADA 16-1水凝膠中則大量死亡，層圓球狀，沒有任何軸突長出。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0025]除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0026]實(shí)施例1:水凝膠的多肽材料制備:
序列I (PI):(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4_精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸溶于超純水后，配置成濃度為5~15ml/mL的溶液，用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7，可得到帶正電荷的短肽水溶液。
[0027]序列2 (P2):(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4_谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸溶于超純水后，，配置成濃度為5~15ml/mL的溶液，用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7，可得到帶負(fù)電荷的短肽水溶液。
[0028]之后將兩者溶液以1:1的體積比混合，靜置后迅速形成凝膠，形狀穩(wěn)定后即可投入使用(見圖1)。
[0029]如圖1所示，兩者混合后形成水凝膠，流動(dòng)性失去。
[0030]原子力顯微鏡顯示納米纖維形貌，由直徑約20 nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，說明所形成的水凝膠是由納米纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，且凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可為細(xì)胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。
[0031 ] 實(shí)施例2:水凝膠的多肽材料制備:
制備方法同實(shí)施例1，
序列3 (ΡΓ ):(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-(賴氨酸)! 10；n為1~10內(nèi)任意一個(gè)自然數(shù)均可。
[0032]序列4(P2’):(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸。
[0033]實(shí)施例3:三維細(xì)胞培養(yǎng)
以超純水為溶劑，配成濃度為5-15 mg/mL的Pl及P2溶液，將細(xì)胞懸液分別與調(diào)整至中性pH的Pl和P2混合，得到均勻的細(xì)胞/短肽混合物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，之后以1:1混合得到包埋有細(xì)胞的三維水凝膠，靜置后迅速形成凝膠，加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0034]實(shí)施例3中包埋細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞球，如圖3和4所示，可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，達(dá)到了 100%的存活率，并長出較長的軸突，而在RADA 16-1水凝膠中則沒有任何軸突長出。
[0035]實(shí)施例4:三維細(xì)胞培養(yǎng)
以超純水為溶劑，配成濃度為5-15 mg/mL的P1’及P2’溶液，將細(xì)胞懸液分別與調(diào)整至中性pH的Pl和P2混合，得到均勻的細(xì)胞/短肽混合物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，之后以1:1混合得到包埋有細(xì)胞的三維水凝膠，靜置后迅速形成凝膠，加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0036]實(shí)施例4包埋細(xì)胞為為神經(jīng)干細(xì)胞球，其檢測后的現(xiàn)象同實(shí)施例3的結(jié)果相同，與RADA 16-1水凝膠相比，本發(fā)明提供的納米纖維水凝膠中可以三維生長，達(dá)到了 100%的存活率，并長出較長的軸突，而在RADA 16-1水凝膠中則沒有任何軸突長出。
[0037]實(shí)施例:5:體內(nèi)原位注射成凝膠
在體內(nèi)缺損部位依次注射Pl和P2，即可形成凝膠。凝膠成中性，不會(huì)對(duì)周圍組織造成傷害。
[0038]在體內(nèi)缺損部位依次注射P1’和P2’，即可形成凝膠。凝膠成中性，不會(huì)對(duì)周圍組織造成傷害。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，其特征在于，包括在RADA16-1序列上分別連接多個(gè)酸性氨基酸和多個(gè)堿性氨基酸，以此形成兩種帶相反電荷的短肽，混合后自組裝形成所述水凝膠的多肽材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，其特征在于，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為 序列1:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸； 序列2:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，其特征在于，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為 序列3:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-(賴氨酸)n; 序列4:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸； 其中，η為1~10內(nèi)任意一個(gè)自然數(shù)。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，其特征在于，將所述兩種帶相反電荷的短肽分別配置成5~15mg/mL的水溶液，按照1:1的體積比混合，調(diào)節(jié)pH至中性，即得所述多肽材料。5.一種權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在組織工程生物支架材料制備中的應(yīng)用。6.一種權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將細(xì)胞懸液分別與所述兩種帶相反電荷的短肽進(jìn)行混合，然后將兩者混合，得到包埋細(xì)胞的水凝膠/細(xì)胞復(fù)合體，并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。8.—種權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在軟骨、血管、神經(jīng)或皮膚的再生和損傷修復(fù)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，所述多肽材料包括在RADA16-I序列上分別連接多個(gè)酸性氨基酸和多個(gè)堿性氨基酸，以此形成兩種帶相反電荷的短肽，混合后自組裝形成所述水凝膠的多肽材料。本發(fā)明提供了一種可在常溫中性pH條件，即在人體生理?xiàng)l件自組裝形成三維多孔納米纖維水凝膠。利用本發(fā)明技術(shù)制備的材料具有更好的生物相容性，可實(shí)現(xiàn)原位負(fù)載細(xì)胞/活性分子以及體內(nèi)原位注射，在細(xì)胞三維培養(yǎng)、組織工程生物支架材料和藥物載體領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N5/00, A61L27/54, A61L27/52, A61K47/42, A61L27/22
【公開號(hào)】CN105169474
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】何留民, 孫雨喬, 吳武田
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日