一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應用
【專利說明】一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應用
[0001]
技術領域
[0002]本發(fā)明屬于材料制備領域，更具體地，涉及一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應用。
【背景技術】
[0003]三維多孔納米支架能夠模仿天然細胞外基質結構，為細胞生長提供支持，廣泛應用于生物醫(yī)學、組織工程學等研究領域。幾乎所有的組織細胞在體內都是在三維條件下生長，細胞被包裹在由膠原纖維作為主要成分組成的納米纖維水凝膠之中，此外，細胞外基質中還含有大量的不溶性基質蛋白和可溶性生長因子。但目前研究中細胞培養(yǎng)技術中所采用的大多都是二維培養(yǎng)，即細胞在培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)，這與體內生長環(huán)境相差較大，影響細胞生長，甚至會引起細胞基因或者功能變化。如何體外構建具有模仿天然細胞外基質結構和功能的人工支架材料，為細胞提供三維生長環(huán)境一直是生物、醫(yī)學以及材料工程領域基礎研究和產品開發(fā)的熱點。
[0004]自組裝短肽RADA16-1是4個重復的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸_丙氨酸序列，即(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4，當其水溶液調節(jié)至PH=7時會形成由納米纖維網絡構成的水凝膠，與天然細胞外基質結構很相似，作為組織工程支架、藥物載體和止血材料在生物醫(yī)學工程領域有廣泛的應用，是自組裝短肽水凝膠材料的典型代表。但是一個顯著的缺點是該材料水溶液具有明顯的酸性(pH=3?4)，不能與細胞懸液和活性分子直接混合原位成凝膠，即很難實現(xiàn)細胞包埋在RADA 16-1水凝膠中進行三維生長。
[0005]目前關于細胞培養(yǎng)的報道仍是采用先制備水凝膠然后在其表面種植細胞的二維培養(yǎng)模式，不能實現(xiàn)真正的三維細胞培養(yǎng)。而將該材料直接注射體內修復損傷和用于止血時較低的PH會對宿主組織造成損害。自1993年首次報道該材料以來，人們對RADA16-1進行了大量的研究，但是對于其酸性的缺點仍不能有效解決。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明根據(jù)目前自組裝水凝膠材料中的不足，提供了一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述多肽材料的制備方法和應用。
[0008]本發(fā)明的技術目的通過以下技術方案實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種中性PH下自組裝成水凝膠的多肽材料，包括在RADA16-1序列上分別連接多個酸性氨基酸和多個堿性氨基酸，以此形成兩種帶相反電荷的短肽，混合后自組裝形成所述水凝膠的多肽材料。
[0009]本發(fā)明是以低分子量自組裝短肽為基礎的水凝膠，為細胞三維生長提供空間，用于構建組織工程支架。本材料可在常溫中性pH條件下形成納米纖維水凝膠，模仿了天然細胞外基質結構，具有良好的理化性能和生物相容性，支持細胞三維生長，滿足組織工程支架的要求，而且可負載活性分子藥物，例如生長因子、短肽藥物?？蓮V泛應用于軟骨、血管、神經、皮膚等人工器官的再生和損傷的修復。
[0010]優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為
序列1:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸；
序列2:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸。
[0011]優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為
序列3:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-(賴氨酸)n;
序列4:(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；
其中，η為1~10內任意一個自然數(shù)。
[0012]申請人發(fā)現(xiàn)，在(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4上接枝賴氨酸，并且與序列4進行混合，賴氨酸的接枝數(shù)量可以為1~10中任意一個自然數(shù)，這樣形成的兩對短肽混合后均可以實現(xiàn)中性PH下自組裝的能力。
[0013]優(yōu)選地，將所述兩種帶相反電荷的短肽分別配置成5~15mg/mL的水溶液，按照1:1的體積比混合，調節(jié)PH至中性，即得所述多肽材料。
[0014]本發(fā)明采用的技術方案是:在短肽(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸)4序列上通過化學共價鍵連接多個酸性氨基酸為主的序列，例如如天冬氨酸和谷氨酸，或者連接多個堿性氨基酸為主的序列，例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸。最終得到在中性PH條件下分別帶有凈正電荷和凈負電荷的兩條短肽序列，溶于水后調整其PH至7，兩者混合后形成三維納米多孔水凝膠。該水凝膠保持中性PH值，三維結構穩(wěn)定。
[0015]本發(fā)明兩對短肽序列的合成是采用了現(xiàn)有的接枝方向獲得，由于目前未有成型的理論支持何種改性(即接枝序列和接枝位置)能夠獲得真正在中性條件下合成的自組裝多肽水凝膠，不同的序列排列方式不同，電荷分布也不同，同時結構內部自組裝方式均會影響最終的接枝效果，因此，上述接枝物的具體接枝位點和接枝序列排布，對最終效果影響非常大。
[0016]與現(xiàn)有多肽自組裝水凝膠相比，本發(fā)明在生理條件下(pH為7-7.4)即可形成三維多孔水凝膠，由直徑約20 nm的納米纖維網絡構成，凝膠網絡結構穩(wěn)定，可為細胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。將含有功能性氨基酸序列引入，能夠促進細胞生長、粘附，同時也可負載活性分子藥物，如生長因子、短肽藥物，獲得控制釋放。也可注射使用，操作簡便，是非常理想的生物材料。
[0017]本發(fā)明所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，并且使用過程都是中性的，不會對細胞核宿主組織產生危害，能夠用于真正的三維培養(yǎng)細胞，方法為將細胞懸液分別與所述兩種帶相反電荷的短肽進行混合，然后將兩者混合，得到包埋細胞的水凝膠/細胞復合體，并加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0018]進一步地，所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在運用于軟骨、血管、神經或皮膚的再生和損傷修復中，具有極大的應用前景。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種可在常溫中性PH條件，即在人體生理條件自組裝形成三維多孔納米纖維水凝膠。利用本發(fā)明技術制備的材料具有更好的生物相容性，可實現(xiàn)原位負載細胞/活性分子以及體內原位注射，在細胞三維培養(yǎng)、組織工程生物支架材料和藥物載體領域具有非常廣闊的應用前景和臨床應用價值。
【附圖說明】
[0020]圖1為兩種修飾改性后的短肽(P1、P2)，混合后形成的水凝膠材料(P1+P2)，向水凝膠擴散的細胞培養(yǎng)基未改變顏色，說明形成的水凝膠呈中性PH ;原子力顯微鏡顯示納米纖維形貌，說明所形成的水凝膠是由納米纖維構成的網絡。
[0021]圖2為三種材料的流變性能對比圖，Pl，P2為改性短肽，P1+P2為兩者混合物。G’為儲能模量，G”為損耗模量。Pl和P2混合后G’大大升高，說明形成了穩(wěn)定的水凝膠。
[0022]圖3為神經干細胞球在不同納米纖維水凝膠中三維生長形貌。A為本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠為RADA 16-1納米纖