后在巧光顯微鏡下觀察、拍照。
[0047] 5、轉(zhuǎn)染率分析
[0048]按N/P比值 20 形成scFv-IP/FAM-siRNAs復(fù)合物，并WIP/FAM-siRNAs復(fù)合物作 為對照，轉(zhuǎn)染Panc-I細(xì)胞。SiRNAs濃度為lOOnmol/l，流式細(xì)胞儀檢測各組轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染 過程具體如下：
[0049] (1)為測定IP/FAM-siRNAs對Panc-I細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，將不同NP比值的IP/ FAM-SiRNAs復(fù)合物轉(zhuǎn)染6小時后棄上清，用PBS洗涂3次，用0. 25%的膜酶-NazEDTA把細(xì) 胞從24孔板上消化下來，900巧m離屯、4分鐘，棄上清。
[0050] 似PBS重懸細(xì)胞，900巧m離屯、4分鐘，去上清。
[0051] (3)用0.5mlPBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。W上均為避光操作。
[0052]6、SiBmi-I轉(zhuǎn)染Panc-I細(xì)胞
[0053]按N/P比值 20 形成scFv-IP/siBmi-1 或IP/siBmi-I復(fù)合物，轉(zhuǎn)染Panc-I細(xì)胞， WIP/SCR作為對照。SiRNAs濃度為lOOnmol/l，選取N/P= 20通過IP向Panc-I細(xì)胞轉(zhuǎn) 染SiBmi-I。Panc-I細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天鋪板密度為2X1(^7孔化孔板）。SiBmi-I濃度為 lOOnmol/L。按N/P比值=20制備IP/FAM-siRNAs復(fù)合物，混勻后室溫靜置20分鐘，然后 加入100y1轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基化ti-MEM中混勻。棄去24孔板中舊DMEM培養(yǎng)基，每孔加入 400ul新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基。然后將上述100y1混合物逐滴加入孔板中，輕輕搖勻。 37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后棄上清，加入新鮮的完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48小時或72小時，分別進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0054] 7、qRT-PCR試驗
[00巧](1)Trizol法抽提RNA
[0056] ①轉(zhuǎn)染48小時后，DEPC處理過的PBS輕輕洗涂細(xì)胞3次，6孔板每孔加Iml Trizol，室溫靜置3分鐘，反復(fù)吹打細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1. 5m化P管，用Iml加樣槍反復(fù)吹吸至無 肉眼可W沉淀，然后室溫靜置5分鐘。
[0057] ②每個EP管加入1/5體積化2ml)氯仿，蓋緊蓋子后，用力搖晃15秒，室溫靜5 分鐘。
[0058]③ 4°C,12,000Xg離屯、15 分鐘。
[0059] ④小屯、吸取上層水相（約400ul)到另一新的1. 5m化P管中，內(nèi)含有細(xì)胞總RNA。
[0060]⑥加入等體積異丙醇（約400ul)，上下顛倒8次，室溫靜置10分鐘。
[0061]⑧ 4°C，12, 000Xg離屯、10 分鐘。
[006引⑦去上清，每個EP管加入Iml冰上預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配），清洗管壁， 盡量勿觸及白色絮狀沉淀物（為RNA)。
[0063]⑨ 4°C,12,000Xg離屯、5 分鐘。
[0064] ⑨去上清，室溫干燥10分鐘（為控制RNA中鹽含量，盡量除凈乙醇）。
[0065] ⑩每管加入20-30ulDEPC水，溶解干燥后的RNA。
[006引似RNA瓊脂糖電泳
[0067] ①電泳槽處理：去污劑洗干凈；水沖洗；乙醇干燥；灌滿3%的雙氧水溶液，靜置 IOmin;0. 1%DEPC沖洗。
[0068] ②電泳緩沖液巧X TB巧：用時稀釋至0. 5 X T邸工作液。
[006引③制備2%瓊脂糖凝膠：0.SOg瓊脂糖+40ml0. 5XT邸緩沖液于微波爐中融化。
[0070] ④待烙化的瓊脂糖冷卻至60°C左右，加入3ul膠體金混勻后緩慢倒入電泳槽中， 注意勿引起氣泡，插上梳子，室溫靜置60分鐘。
[0071] ⑥拔去梳子，將IOuIRNA溶液與化1 6X上樣緩沖液混勻后小屯、加入加樣孔中。
[0072] ⑧在5v/cm的電壓下電泳30分鐘左右，此時漠酪藍(lán)帶跑到電泳槽中央，在凝膠呈 像儀WUV照射下觀察條帶，W確定RNA的純度。
[0073] (3)微量核酸蛋白測定儀測定RNA的0〇26。和OD28。值
[0074] 微量核酸測定儀測定提取RNA的OD值，W評估其純度和計算其濃度，其中0〇23。值 代表鹽含量，ODze。代表核酸含量，OD28。值代表蛋白質(zhì)含量，OD32。值代表溶劑的吸光度。OD2e。/ 〇〇28。的比值在1. 8-2. 0之間，表明RNA無明顯蛋白質(zhì)污染。RNA原液濃度二伽2e。-孤32。）X 稀釋倍數(shù)X40(ng/yl)。
[00；/引 （4)cDNA的合成
[0076] ①在PCR管中加入W下反應(yīng)混合物（冰上操作）
[0077] 試劑 使用量 終濃度 SxPrimoScripl^''BuITcr 2[_!iIx PrinicScript^''RTEnzymeMixI0.5).il OligociTPrimcr(50j..tM) 0.5j.i! 25pmol 民andom6mers(lOOjiM) 0.非il 50pmol TotalKNA 0.5ug
[0078] RNasoFreedH2〇 叩U) 1(叫
[0079] ②輕輕混勻，微型離屯、機離屯、3-5秒。
[0080] ③反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下
[0081] 37°CISmin
[0082] 85°C5sec
[0083] ④合成的cDNA放-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0084] (S)RealTimePCR反應(yīng)
[0085] ①在96孔PCR板中每孔加入W下PCR反應(yīng)液（冰上操作）
[0086] SY B民PrcmixExTaqi、MlIOyI PCR Forwi-.rd Primer (i 0|.iM) 0.4j,i! PCR Reverse Primer (!O.uM) 〇.4(il cDNA溶液 化I 瓶游 8.2拇
[0087]② 4°C,3,000Xg離屯、3 分鐘。
[008引③按下列反應(yīng)條件進(jìn)行RealTimePCR反應(yīng)
[0089] 概'劃'1:. <：)5C 3化CC 1Cycle rc及疫應(yīng) 5SCC 1 > 40 Cycles 60 "C 30scc 溶解曲線分析 95 rOsec 65 °(： !5sec 95V 化CC
[0090] 8、Westernblot試驗
[0091] (1)細(xì)胞總蛋白提取
[0092] 轉(zhuǎn)染72小時后提取細(xì)胞總蛋白，過程如下：
[0093] ①棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗細(xì)胞一遍。
[0094] ②每孔加入100y1RIPA和1y1PMSF(終濃度為ImM)。
[0095] ③細(xì)胞刮刮數(shù)下，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，冰上裂解30分鐘。
[0096]④ 4°C，12, 000Xg離屯、30 分鐘。
[0097] ⑥小屯、吸取上清，內(nèi)含有細(xì)胞總蛋白。
[009引 似蛋白濃度測定
[0099]BCA-IOO蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度（96孔板法），具體過程如下：
[0100] 按A:B= 50:1制備A+B混合液，即每個反應(yīng)使用200y1SolutionA+4y1 SolutionB，混勻后使用，即配即用。每個樣品要做3個平行孔。
[0101 ] ①BSA柄;準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用PBS配制，稀釋5倍巧Ji1蛋白原液 +20ylPBS)，使待測定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個反應(yīng)準(zhǔn)備3個平行測定。標(biāo) 準(zhǔn)曲線一般取5-6個點即可，根據(jù)樣品的濃度確定各點的具體濃度。BSA也用PBS稀釋。按 下表的次序加入BSA標(biāo)準(zhǔn)品或樣品及SolutionA+B混合液，混勻。
[0102]
[0103] ③蓋上蓋子混合30秒，37°C解育30分鐘。
[0104] ④冷卻至室溫。
[0105] ⑥酶標(biāo)儀上測定490皿的吸光度值（OD值）。
[0106] ⑧用Excel軟件分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2> 0. 99曲線可用。根據(jù)未知樣品的吸光 度值，用公式：y= 0. 2729X+0. 0793(y=吸光度，X=蛋白濃度，R2= 0. 9994)可W得出未 知樣品的濃度，實際濃度需要乘W樣品的稀釋倍數(shù)。
[0107] (3)制膠。依次制備12%分離膠和5%濃縮膠。
[0108] (4)蛋白標(biāo)本的制備：每孔上樣標(biāo)本量相同（25yg)，在0.2m化P管中分別加入： 樣品蛋白（25yg)+4ylSXloadingbuffer+RIPA(含 1%PMS巧，總體積 20^1。
[0109] (5)蛋白變性。蛋白樣品與5X蛋白上樣緩沖液混勻，置于IOCTC水浴8分鐘，瞬 時離屯、，冷卻至室溫，直接上樣或-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0110] 化）上樣。每孔20^1，空白孔力日ISylRIPA+5yl5X蛋白上樣緩沖液，在邊緣 孔上預(yù)染蛋白marker。
[0111] (7)電泳。濃縮膠60V恒壓電泳，當(dāng)漠酪藍(lán)至分離膠時，改用120V恒壓電泳，至漠 酪藍(lán)至分離膠底部，停止電泳。
[0112] (8)轉(zhuǎn)膜。PVDF膜剪去右上角W標(biāo)記方向，然后將標(biāo)記好的PVDF膜置于甲醇中活 化IOmin后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中備用。從玻璃板中取下凝膠，按照一定的順序?qū)⒑＞d、濾紙、 凝膠、PVDF膜置放于電轉(zhuǎn)夾上，放入電轉(zhuǎn)槽中，150mA恒流電轉(zhuǎn)60min。
[0113] (9)封閉。轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜，TBST洗5minX3次，置于封閉緩沖液中室溫封閉 2h〇
[0114] (10)解育一抗。用抗體稀釋液稀釋一抗（TubulinmAb1:1000,Bmi-ImAb1 : 2000)。根據(jù)預(yù)染蛋白marker大小切PVDF膜，分別解育一抗，4°C搖床過夜。TBST洗膜 5minX3 次。
[011引 （11)解育二抗。用抗體稀釋液稀釋二抗（1 :1000)，室溫解育二抗2小時。TBST洗 膜 5minX3 次。
[0116] (12)曝光。把PVDF膜置于曝光盒內(nèi)，均勻涂上化學(xué)發(fā)光液，蓋上膠片，暗室內(nèi)曝 光0.5-5min。把膠片置于顯影液中顯影，定影液中定影。觀察條帶。用ImageJ軟件分析 圖像。
[0117] 9、細(xì)胞增殖試驗
[0118] (1)Panc-I細(xì)胞接種在96孔板，1XIO^孔，無抗生素完全培養(yǎng)基中貼壁生長24小 時。
[011引 似去除舊培養(yǎng)基，分別加入IP/SCR和IP/siBmi-l(N/P= 20)復(fù)合物及新鮮培養(yǎng) 基共100yI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各復(fù)合物所含SiRNAs量設(shè)定為lOOnM。
[0120] (3) 37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后更換為新鮮無抗生素完全培養(yǎng)基，每孔 lOOul，繼...