血栓靶向釋放rgdv的抗栓劑聚天冬酰-rgdv的合成和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及血栓祀向的聚天冬醜-RGDV，涉及它的制備方法，涉及它的納米結構， 涉及它在大鼠血栓模型上的祀向抗血栓作用。因而本發(fā)明闡明了聚天冬醜-RGDV作為革己向 抗血栓劑的臨床應用前景。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。
【背景技術】
[0002] 血小板血栓是血栓形成的起始階段，可W分為血小板粘附、活化和聚集H個過程。 在血小板血栓形成過程中，血小板膜上GPHb/IIIa活化，構象發(fā)生改變，然后在Ca2+的參與 下，與纖維蛋白原或VWF上的RGD四膚序列特異性結合將血小板和紅血球偶聯(lián)起來，形成血 栓。在血小板聚集過程中，纖維蛋白原或VWF上的RGDV與活化的血小板表面受體GPIIb/ IIIa結合起至關重要的作用。外源性RGDV與被GPIlb/IIIa識別并競爭性抑制纖維蛋白 原或VWF與血小板結合，抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板，送些血小板 是血栓形成的重要構件。如果能把RGDV定向釋放到血栓形成部位，就可W使送些活化的血 小板不能參與血栓形成，從而有效地抑制血栓形成?？墒?，送個目標在本發(fā)明申請之前沒有 達到。根據(jù)送些認識，發(fā)明人提出了本發(fā)明。本發(fā)明的突出創(chuàng)造性在于用聚天冬醜-RGDV 將RGDV輸送到血栓形成部位，然后在血栓中有效地釋放RGDV，發(fā)揮祀向抗血栓作用。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的第一個內容是采用常規(guī)的液相合成，逐步接膚制備肥1 'ArgUos)-Gly-A SP(OBzl)-Val-OBzl。
[0004] 本發(fā)明的第二個內容是采用標準方法，制備平均分子量為20964,鏈長為173個天 冬氨酸殘基的聚天冬氨酸。
[0005] 本發(fā)明的第H個內容是采用邸C法將肥1 .Arg燈OS)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl 偶聯(lián)到聚天冬氨酸的駿基上然后脫去RGDV的側鏈和駿端保護基，制備聚天冬醜-RGDV。
[0006] 本發(fā)明的第四個內容是測定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性。
[0007] 本發(fā)明的第五個內容是測定聚天冬醜-RGDV的抗血栓活性。
[0008] 本發(fā)明的第六個內容是測定聚天冬醜-RGDV對GPIIb/IIIa的影響。
[0009] 本發(fā)明的第走個內容是測定聚天冬醜-RGDV在血栓中釋放RGDV。
[0010] 本發(fā)明中所出現(xiàn)的縮略語的說明：
[0011] RGDVArg-Gly-Asp-Val
[001引 PD 聚天冬氨酸
[0013] 聚天冬醜-RGDV 聚天冬醜-Arg-Gly-Asp-Val
[0014] THF 四氨巧喃
[001引 DCC 二環(huán)己基醜亞胺
[001引 DCU 二環(huán)己基脈
[0017] OBzl 予氧基
[0018] Boc 叔了氧撰基
[001引 Tos 對甲苯礙酸基
[0020]OMe 甲氧基
[0021]HOBtN-居基苯并H哇
[0022]NMMN-甲基嗎晰
[0023] 邸C 1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺
[0024]PAF 血小板活性因子
[00巧]ADP 腺巧二磯酸
[002引 AA 花生四帰酸
[0027] TE 凝血酶
【附圖說明】
[002引 圖 1.聚天冬醜-RGDV的合成路線.U85% &?04,180。減壓；iUrfeOH,H20,0°C; iii化DC/HOBt;iv)DCC，Ho化，(TC;v)化0H(2N)，H20,0°C;vi)氯化氨的己酸己醋溶液（4腳；vi^CFsCOzH，CF3SO3H。
[0029] 圖2.聚天冬醜-RGDV治療的大鼠血液提取物的FT-MS譜。
[0030] 圖3.聚天冬醜-RGDV治療的大鼠血栓提取物的FT-MS譜。
【具體實施方式】
[0031] 為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。送些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。
[0032]實施例 1 制備肥1? ArgUos)-Gly-Asp((Bzl)-Val-Cffizl
[0033] 1)制備Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl
[0034]將 4. 986g(ll. 64mmol)Boc-Arg燈OS)，1. 310g(9.Tmmol)冊化溶于 30血無水THF, 往得到的溶液中加2. 398g(11. 64mmol)DCC的無水THF溶液，冰浴攬拌20min，得到反應液 I。 將3. 273g巧.7mmol)Tos?Gl廠OBzl與30血無水THF的溶液用NMM調抑9,得到反應液 II。 將反應液II加到反應液I中，室溫反應12小時。化C(丙麗：石油離=2 : 1)顯示反 應完成。過濾除去DCU沉淀，濾液減壓濃縮，殘留物用150mL己酸己醋溶解，過濾除去DCU 沉淀。濾液分別用飽和Na肥〇3巧0血X1)，5 %Na肥〇3巧0血X2)，飽和化CU50血X3)，5 % KHS04巧OmLX3)，飽和NaCUSOmLX3)，5 %NaHC〇3巧OmLX3)，飽和NaCUSOmLX3)洗，加無 水化S〇4干燥。濾出干燥后的己酸己醋溶液，減壓濃縮得到的5. 339g淡黃色固體粗品用娃 膠柱純化（丙麗：石油離=1 : 4)，得到4.93g(88%)純品，為無色固體。
[0035] 2)制備Boc-Arg(Tos)-Gly
[0036]在冰浴下將 5. 291g化 19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl溶于 20血甲醇，往得到 的溶液中加14血化OH水溶液（2腳，攬拌1小時，TLC(丙麗：石油離=1 : 1)顯示反應完 成。反應液用飽和K服〇4調抑7,減壓濃縮。殘留液先用化OH水溶液（2腳調抑9,再用己離 萃取。水層用飽和K服〇4調抑2,用50血己酸己醋萃取3次，合并的己酸己醋萃取液加無水 化S〇4干燥。濾出干燥后的己酸己醋溶液，減壓濃縮得到3. 782g(84% )Boc-Arg燈os)-Gly， 為無色固體。ESI-MS(m/e) :377[M+田+。
[0037] 3)制備Boc-Asp((Bzl) -Val-Cffizl
[0038]按照制備Boc-Arg燈os)-Gly-OBzl的方法，從 2. 716g(8. 4mmol)Boc-Asp(OBzl)和 2. 657g(7mmol)Tos?Va^OBzl，得到 2. 8225g(79 % )Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl,為無色固 體。
[0039] 4)制備肥1 ?Asp(OBzl) -Val-OBzl
[0040]在冰浴下將 7. 8345g(15. 2mmol)Boc-Asp(OBzI)-Val-OBzl溶于6血己酸己醋 中，往得到的溶液中加入20mL氯化氨的己酸己醋溶液，攬拌4小時，化C(丙麗：石油離 =1 : 5)顯示反應完成，減壓抽去己酸己醋。殘留物加20mL無水己離溶解，溶液減壓濃 縮。該操作反復5次，W除去產品中的氯化氨。殘留物最后加5mL無水己離研磨，得到 0. 864g(90%)產品，為無色粉末，直接用于下一步反應。ESI-MS(m/e) ;413[M+田+。
[0041]巧制備Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
[0042]按照制備Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，從 4005mg(8. 247mmol) Boc-Arg燈os)-Gly和 3. 106g化.873mmol)肥I.Asp(OBzl)-Val-OBzl得到 5. 9g(97% )Boc-Arg燈os) -Gly-Asp(OBzl) -Val-OBzldESI-MS(m/e) ;880 [M+田VhNMR巧OOMHz，CDCI3)d/卵m =7. 72 (s, 3H), 7. 49 (s, 2H), 7. 29 (d, 10H), 7. 24 (s, 2H),6. 44 (m, 2H), 5. 64 (m, 1H), 5. 07 (m, 4H)，4.86(S，1H)，4. 37 (d，J= 5. 5Hz，1H)，4. 23 (m，1H)，3. 97 (d，J= 15Hz，1H)，3. 82(S，1H)， 3. 17 (s，IH)，2. 92 (d，J= 16. 5Hz，IH)，2. 82 (s，IH)，2. 33 (d，3H)，2. 08 (m，3H)，I. 79 (s，IH)， 1. 63 (s，IH)，I. 55 (s，2H)，I. 38 (d，細），I. 25 (m，IH)，0. 82 (m，細）."cNMR(125MHz，CDCI3)d/ 卵m= 171. 55,171. 35,170. 50,，169. 55,157. 06,142. 05,140. 70,135. 42,135. 38,129. 22， 128. 54,128. 37,128. 26,128. 17,125. 99,80. 15,77. 24, 76. 98, 76. 73,66. 95,66. 91,58. 01, 53. 92,49. 50,43. 30, 36. 00, 30.66, 28. 35, 25. 32, 21. ：M，18. 94,17. 80,14. 17。
[0043]6)制備肥I?Arg燈〇3)-Gly-Asp((BzI)-Val-CffizI
[0044]按照制備肥I.Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法，從I. 90g(2. 16mmol)Boc-Arg(Tos)-G Iy-Asp(OBzl)-Val-OBzl得I. 621g(92% )肥I?Arg〇'os)-Gly-Asp(OBzl)-Val-〇Bzl固體， 直接用于下一步反應。ESI-MS(m/z)817[M+田+。
[004引實施例2巧[J備聚天冬氨酸
[0046] 1)制備聚了二醜亞胺
[0047] 將 20.OgDikAsp和 10. 4邑&?〇4(85%)混勻并在 180°C減壓（0.IMPa)反應 3. 5 小 時。反應物趁熱產物用SOmLDMF溶解，得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗 抽濾，濾餅磨碎成粉末，用水洗至中性，35C減壓干燥至恒重，得到14. 4g(98.8% )聚了二 醜亞胺，為淡灰色粉末。電NMR巧OOMHz，CDCls)d/卵m; 5. 294 ( 了二醜亞胺的H-：3)，3. 233 ( 了 二醜亞胺的H-4)."CNMR(125MHz，CDCI3)d/卵m; 173. 96 ( 了二醜亞胺的C-3)，172. 69 ( 了二 醜亞胺的C-1)，47. 82 ( 了二醜亞胺的C-4)，33. 10 ( 了二醜亞胺的C-5).IR6/cm1 ; 1711 和 1801 ( 了二醜亞胺的C= 0)，1160 和 1213( 了二醜亞胺的C-N)。
[0048] 2)制備聚天冬氨酸
[0049] 冰浴下將3g聚了二醜亞胺和1. 4g化OH用20mL水溶解，攬拌1小時，用濃度為 35 %的鹽酸調抑1，得到的溶液倒入300血甲醇中。濾出生成的沉淀在4(TC真空干燥， 得3.2g聚天冬氨酸，為淡黃色固體。采用凝膠滲透色譜-多角激光光散射法測得聚天冬 氨酸的數(shù)均分子量（Mn)20964g/mol，重均分子量（Mw)為30476g/mol，分子量分布（d)為 I. 4537,數(shù)均聚合度為 173。[a]〇25 =I. 21(C= 0. 01，&0)。"CNMR(125MHz，CDCl3)dA)pm=177. 87,173. 41，172. 75,172. 05,171. 89,51. 76,51. 60,39. 12,37. 61。
[0050]實施例 3 制備聚天冬醜-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl
[0051] 先將89mg化77mmol)聚天冬氨酸溶于1血無水DMF,冰浴下加入104mg(0. 77mmol) 冊Bt和 296mg(l. 54mmol化DC，0. 5 小時后加入 628mg(0. 77mmol)肥I?八'邑燈〇3)-617-八3口（ OBzD-Val-OBzl,NMM調抑9。室溫攬拌24小時，TLC(二氯甲焼：甲醇，5 : 1)顯示