亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

血栓靶向釋放rgdv的抗栓劑聚天冬酰-rgdv的合成和應(yīng)用_2

文檔序號(hào):8951971閱讀:來源:國知局
肥1* ArgUos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干,殘留物依次用己離 (20血X如,20血K服〇4水溶液巧% )和&0 (20血X如研磨,得到的固體經(jīng)37 〇C真空干燥48 小時(shí)重664mg,為淡黃色。直接用于下一步反應(yīng)。
[0052] 實(shí)施例4制備聚天冬醜-Arg-Gly-Asp-Val(聚天冬醜-RGDV)
[0053]冰浴下將 664mg聚天冬醜-Arg(Tos) -Gly-Asp- (OBzl) -Val-OBzl溶于 6血H氣己 酸,往得到的溶液中加入2血H氣甲礙酸,攬拌90分鐘。反應(yīng)混合物用己離洗(150血X3), 殘留物溶于50血水,用化OH水溶液(2腳調(diào)抑7。得到的混濁液離必30分鐘,上層清液 用孔徑為5000的透析膜透析72小時(shí),截留的殘留物冷凍干燥,得196mg(73% )聚天冬 醜-RGDV,為乳白色固體。[a]〇25 = -29. 00(C= 0. 01,&0)。i3cNMR(125MHz,CDCl3)dA)pm =177. 78,176. 98,175. 80,173. 89,173. 21,172. 42,171. 02,156. 79,62. 44,62. 20,60. 81, 58. 72,53. 77,51. 37,50. 61,48. 94,42. 50,40. 63,38. 12,36. 49,35. 85,34. 99,30. 73, 30. 05,28. 01,24. 53,18. 69,18. 41,17. 38,13. 48。按照數(shù)均聚合度為 173 計(jì)算,聚天冬 醜-RGDV的分子量為87985。
[0054] 實(shí)施例5測定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性
[005引 1)制備2XIO8血小板/mL血漿
[0056] 用1 %的娃離溶液將采血容器娃焼化。在娃焼化的容器中收集豬血,按照豬血:抗 凝劑9 : 1 (體積比)加入構(gòu)稼酸鋼(3.8% )抗凝,水平緩慢晃勻。將抗凝的豬血在120g 離必10分鐘,得到的上清液即是富血小板血漿(PRP)。殘留的豬血繼續(xù)在1500g離必10分 鐘,得到的上清液即是貧血小板血漿(PPP)。光學(xué)顯微鏡下觀察,用PPP調(diào)PRP使血小板數(shù) 目為2X1〇8血小板/mL血漿。
[0057] 2)測定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性(I巧0)
[005引在血小板聚集分析儀測量管內(nèi)加入240U LPRP,輕微攬拌下37C溫育10分鐘,調(diào) 零。大約1分鐘后加入5UL生理鹽水(空白對(duì)照)或西洛他哇的生理鹽水溶液(陽性對(duì)照, 終濃度為ImM)或聚天冬醜-RGDV的生理鹽水溶液(終濃度為0. 01,0. 1,1. 0,10,100yM)。 大約1分鐘后加入5ULADP的生理鹽水溶液(終濃度為500UM)或PAF的生理鹽水溶液 (終濃度為50UM)或AA的生理鹽水溶液(終濃度為7. 5mg/mL)或TE的生理鹽水溶液(終 濃度為50U/mL)。待濁度從100下降進(jìn)入平臺(tái)期,記錄約6分鐘的穩(wěn)定曲線為最大聚集率, 計(jì)算各種濃度下聚天冬醜-RGDV對(duì)血小板聚集的抑制率。每個(gè)濃度平行測6次,求平均值。 計(jì)算式為抑制率% =(生理鹽水存在下的血小板聚集率-聚天冬醜-RGDV存在下的血小板 聚集率)/生理鹽水存在下的血小板聚集率。按照5種濃度聚天冬醜-RGDV存在下血小板 聚集的抑制率,計(jì)算ICe。值。用ICw表示活性,結(jié)果見表1。
[0059] 表1聚天冬醜-RGDV對(duì)ADP,PAF,AA和TH誘導(dǎo)的血小板聚集的影響(n=6) *
[0060]
[0061] *聚天冬氨酸未測出抗血小板聚集活性.
[006引表1的數(shù)據(jù)說明,與RGDV相比聚天冬醜-RGDV抑制ADP,PAF,AA和TE誘導(dǎo)的血小 板聚集的活性分別高202, 218, 2339和5844倍??梢妼GDV連接到聚天冬氨酸上,大大提 高了RGDV的抗血小板聚集活性。
[0063] 實(shí)施例6測定聚天冬醜-RGDV對(duì)GPIIb/IIIa的抑制作用
[0064] 1)制備聚天冬醜-RGDV處理的活化血小板樣品
[0065] 雄性SD大鼠(220~230g)按1200mg/kg劑量腹腔注射烏拉坦水溶液使麻醉。在 娃焼化的容器中收集大鼠動(dòng)脈血,加1/9體積的構(gòu)稼酸鋼(3.8% )抗凝,水平緩慢晃勻, 120g離必10分鐘,取上清液,得到PRP血漿。向96UL血漿中加入2UL聚天冬醜-RGDV 的生理鹽水溶液(終濃度50nM),賠育5分鐘,加2ULAA的生理鹽水溶液(終濃度7. 5mg/ 血),37°C溫育3分鐘。
[0066] 2)測定聚天冬醜-RGDV對(duì)GPIIb/IIIa抑制作用
[0067] 按照GPnb/IIIaELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)的標(biāo)準(zhǔn)方法,96孔 板室溫平衡20分鐘,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和聚天冬醜-RGDV孔。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用的標(biāo)準(zhǔn)品孔先 加50UL試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)溶液(終濃度為1600,800,400, 200,100和Ong/mL),再加IOOiiL 辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體。聚天冬醜-RGDV孔先加96ULPRP血漿和10UL聚天冬 醜-RGDV的生理鹽水溶液(終濃度50nM),37 °C賠育5分鐘,再加2ULAA的生理鹽水溶液 (終濃度7. 5mg/mL),37 °C溫育3分鐘,后加40UL試劑盒的樣本稀釋液。RGDV孔先加96UL PRP血漿和10ULRGDV的生理鹽水溶液(終濃度25mM),37°C賠育5分鐘,再加2ULAA的 生理鹽水溶液(終濃度7. 5mg/mL),37 °C溫育3分鐘,后加40UL試劑盒的樣本稀釋液???白孔孔先加96ULPRP血漿和10UL生理鹽水,37°C賠育5分鐘,再加2ULAA的生理鹽水 溶液(終濃度7. 5mg/mL),37°C溫育3分鐘,再加40UL試劑盒的樣本稀釋液,后加100UL 試劑盒的辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體。96孔板用封板膜封孔,37C賠育60分鐘。每個(gè) 孔重復(fù)3次。
[006引 3)洗板/顯色和測定
[0069] 各孔棄去溶液后在吸水紙上拍干,加滿試劑盒的洗涂液,靜置1分鐘。甩去洗涂液 后在吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次。各孔加入50UL試劑盒的底物A和50UL試劑盒 的底物B,37°C避光賠育15分鐘。向各孔加50UL試劑盒的終止液,15分鐘內(nèi)在450nm波 長處測定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GPIIb/IIIa的量,結(jié)果見表2??梢妼GDV連 接到聚天冬氨酸上,大大提高了RGDV抑制GPHb/IIIa的活性。
[0070] 表2聚天冬醜-RGDV對(duì)GPIIb/IIIa抑制作用*
[0071]
[007引 *聚天冬醜-RGDV的濃度為50nM,RGDV的濃度為25mM,n= 3.a)與NS組比P < 0. 05.
[0073] 表2的數(shù)據(jù)說明,聚天冬醜-RGDV可有效地抑制GPHb/IIla。與RGDV相比聚天冬 醜-RGDV抑制AA活性的血小板上GPnb/IIIa的活性是RGDV的50萬倍??梢妼GDV連 接到聚天冬氨酸上,大大提高了RGDV對(duì)GPHb/IIIa的抑制活性。
[0074] 實(shí)施例7測定聚天冬醜-RGDV的抗血栓活性 [007引 1)給藥
[0076] 雄性SD大鼠(220~230g)分別口服生理鹽水(3ml/kg),阿斯匹林的生理鹽水溶 液(167Umol/kg),聚天冬醜-RGDV的生理鹽水溶液(Inmol/kg),RGDV的生理鹽水溶液(劑 量為Symol/kg),W及聚天冬氨酸(Inmol/kg)和RGDV(InmolAg)的混合物的生理鹽水溶 液。各10只大鼠,30分鐘之后進(jìn)行下面的手術(shù)。
[0077] 2)大鼠手術(shù)與插管
[0078] 雄性SD大鼠(220~230g)按1200mg/kg劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻 醉大鼠仰邸位固定,分離右頸總動(dòng)脈,于近必端夾動(dòng)脈夾,近必端和遠(yuǎn)必端分別穿入手術(shù) 線,將遠(yuǎn)必端的手術(shù)線于皮毛用止血謝夾緊,準(zhǔn)備在遠(yuǎn)必端插管。
[0079] 插管為娃焼化過的聚己帰膠管,分H段。中段為聚己帰膠管,長6畑1,內(nèi)徑3. 5mm。 另外兩段聚己帰管,長10cm,內(nèi)徑1. 0mm,外徑2. 0mm。它們的一端拉成外徑為1.Omm的尖管 (用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)。將編好號(hào)的干凈青霉素小瓶中分別裝入6cm長的娃焼化 黑色手術(shù)線,稱重,放入中段插管中。
[0080] 打開大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾,用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液巧OIU/ kg),然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈,將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠體內(nèi)。夾 閉右側(cè)頸動(dòng)脈夾,將插管的靜脈端插入分離好的大鼠左側(cè)頸靜脈,打開動(dòng)脈夾,使血液開始 循環(huán)。并同時(shí)開始計(jì)時(shí)15分鐘。
[0081] 3)血栓稱重
[0082] 15分鐘后,剪斷動(dòng)靜脈插管,停止循環(huán),用眼科綴小必取出絲線,在濾紙上輕輕廳 掉血滴,放入事先稱重好的青霉素小瓶中,精確稱重并記錄,計(jì)算的血栓濕重代表活性,結(jié) 果見表3。
[0083] 表3聚天冬醜-RGDV對(duì)在大鼠曲栓形成的影響*
[0084]
[00財(cái)袖=10 ;a)與生理鹽水和聚天冬氨酸+RGDV比P< 0.Ol;b)與阿司匹林比P> 0. 05.
[008引表3的數(shù)據(jù)說明,聚天冬醜-RGDV可有效地抑制大鼠形成血栓。與阿司匹林相比 聚天冬醜-RGDV的活性是阿司匹林的167000倍??梢妼GDV連接到聚天冬氨酸上,大大 提高了RGDV對(duì)大鼠形成血栓的抑制活性。
[0087]實(shí)施例7測定聚天冬醜-RGDV的血栓祀向作用
[008引收集實(shí)施例6中接受聚天冬醜-RGDV治療的大鼠的500mg血液加ImL構(gòu)稼酸鋼 的水溶液(3. 8% )抗凝,4°C和3000g離必10分鐘,上清液與2血甲醇充分混合,于4°C和 12000g離必10分鐘,取10UL進(jìn)樣測定FT-MS。在血液提取物的質(zhì)譜圖中沒有發(fā)現(xiàn)任何與 聚天冬醜-RGDV相關(guān)的峰(圖2)。測定結(jié)果說明,聚天冬醜-RGDV抑制大鼠血栓形成時(shí),快 速在血液中消失、不釋放RGDV、不代謝。
[0089]收集實(shí)施例6中接受聚天冬醜-RGDV治療的大鼠插管中的50mg血栓先用2mL高 純水洗,然后用2mL高純水制備勻漿。得到的勻漿于4°C和3000g離必10分鐘,上清液與 2血甲醇充分混合,于4°C和12000g離必10分鐘,取10UL進(jìn)樣測定FT-MS。在血栓提取物 的質(zhì)譜圖中看到RGDV加H的峰(446. 34043,圖3)。測定結(jié)果說明,聚天冬醜-RGDV抑制大 鼠血栓形成時(shí),快速進(jìn)入血栓并釋放RGDV??梢姡厶於h-RGDV具有血栓祀向作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV。2. 根據(jù)權(quán)利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV,其特征在于:所 述聚天冬氨酰-RGDV的聚天冬氨酰的聚合度為173。3. 制備權(quán)利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV方法,該方法包括 下面四個(gè)步驟。 (1) 采用液相合成方法,逐步接肽合成HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl; (2) 聚合度為173的聚天冬氨酸的制備方法; (3) 把HCl.Arg(T0s)-Gly-AsP(OBzI)-Val-OBzl連接到聚合度為173的聚天冬氨酸的 側(cè)鏈羧基上,制備聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl; (4) 脫去聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl的保護(hù)基。4. 權(quán)利要求1血栓靶向釋放RGDV的抗血栓劑聚天冬氨酰-RGDV在制備抗血栓藥物中 的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及血栓靶向的聚天冬酰-RGDV,涉及它的制備方法,涉及它的納米結(jié)構(gòu),涉及它在大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本發(fā)明闡明了聚天冬酰-RGDV作為靶向抗血栓劑的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【IPC分類】A61P7/02, C08G73/10, A61K47/48, A61K38/07
【公開號(hào)】CN105169401
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】趙明, 彭師奇, 王玉記, 吳建輝, 陳雙玲
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2014年6月19日
當(dāng)前第2頁1 2 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1