758137);胎牛血清（浙江天 杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司批號：2010/04) ;EDTA(AMRESC0 公司批號：2009/10)penicillinGSodiumSalt(AMRESC0 公司批號：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESC0公司批號：2010382);無水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司 批號：080310182) ;MTT(Biosharp批號：0793) ;PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）；1.4 實(shí)驗(yàn)器材
[0031] 萊卡倒置顯微鏡（德國Leica型號：DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀（美國MD 公司型號：SPECTRAMAX190) ;C02培養(yǎng)箱（FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團(tuán)安泰公 司制造型號：SW-CJ-ZFD);純水儀（美國Spring公司型號：S/N020579);精密移液器（法 國吉爾森公司型號：P2);電子天平（德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅 菌鍋（日本SANYO公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型 號：DHG9123A);冰箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心 機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠型號：KA-1000) ;0? 2ym濾器（MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ;10cm 培養(yǎng)皿（NEST公司）、96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0032] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0033] 1)鼠大腸癌CT-26細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培 養(yǎng)皿），當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0. 25 %胰 蛋白酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后 將其轉(zhuǎn)入離心管中，l〇〇〇rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X104個/ml。
[0034]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180y1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0035] 3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50% -70%，加入含絞股藍(lán)的植物組合物溶液，繼 續(xù)培養(yǎng)24h。
[0036]4) 24h后加入 20y1MTT溶液（5mg/ml，即 0? 5 %MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0037] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200y1二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0038] 6)同時設(shè)置本底（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解 介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0039] 7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示：
[0040] 細(xì)胞增值抑制率（％ )=(對照孔0D值-給藥孔0D值）/對照孔0D值X100 %。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0041] 3統(tǒng)計處理
[0042] 采用MicrosoftExcel2003軟件中的相關(guān)分析和Studentt檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以 meaniS.D.表不。
[0043] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044] MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對鼠大腸癌 CT-26細(xì)胞增殖抑制有差異（P〈0. 05)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑 量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1含絞股藍(lán)的植物組合物對鼠大腸癌CT-26細(xì)胞增殖抑制影響研究
[0046] 這士SD)
[0047]
[0048]
[0049] 注：與對照組比較，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0050] 5實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0051] 含絞股藍(lán)的植物組合物可以抑制鼠大腸癌CT-26細(xì)胞增殖，減少鼠大腸癌CT-26 細(xì)胞的細(xì)胞生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含絞股藍(lán)的植物組合物提取方法，其特征在于植物組合物由絞股藍(lán)l〇〇g，滑葉 跌打50g、草血竭60g、蛇含170g作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成：取上述原料 藥，粉碎，加入2L的70 %乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率為400-600W， 萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50 %乙醇洗脫， 收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，加常規(guī)輔料制備成 片劑、膠囊或顆粒劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種含絞股藍(lán)的植物組合物提取方法，其特征在于制備方法中 微波萃取功率為500W，每次萃取6分鐘。3. -種含絞股藍(lán)的植物組合物在抑制鼠大腸癌CT-26細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征 在于含絞股藍(lán)的植物組合物由絞股藍(lán)l〇〇g，滑葉跌打50g、草血竭60g、蛇含170g作為原料 藥制成，制備方法由下列步驟組成：取上述原料藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃 取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率為400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮， 加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃 縮并干燥，得微波提取物，加常規(guī)輔料制備成片劑、膠囊或顆粒劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種含絞股藍(lán)的植物組合物在抑制鼠大腸癌CT-26細(xì)胞增殖藥 物中的應(yīng)用，其特征在于制備方法中所述微波萃取功率為500W，每次萃取6分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含絞股藍(lán)的植物組合物提取方法，由絞股藍(lán)100g，滑葉跌打50g、草血竭60g、蛇含170g作為原料藥制成，采用微波提取方法制備而成，使得含量有很大提高，用量減少，本發(fā)明還提供了含絞股藍(lán)的植物組合物在制備抑制鼠大腸癌CT-26細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K36/73, A61P35/00
【公開號】CN105168433
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】嚴(yán)白雙
【申請人】南京市棲霞區(qū)回春堂電子商務(wù)咨詢中心
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月11日