沖液（PBS)洗一遍，換上無血清無酚紅的低糖DMEM 培養(yǎng)液，分組加受試藥。
[0032] 設空白對照組（加入正常細胞培養(yǎng)液100 yL)，模型組（加入含liiM的胰島素的 細胞培養(yǎng)液100yL)，五味子乙素組（加入含1yM的胰島素及10yM的五味子乙素的細胞 培養(yǎng)液1〇〇yU，以及二甲雙胍陽性對照組（加入含1yM的胰島素及ImM的二甲雙胍的細 胞培養(yǎng)液100 y L)。作用24小時后，用葡萄糖氧化酶法測定每孔培養(yǎng)液的葡萄糖含量，即每 孔取5 y L培養(yǎng)液于另一96孔板中，加入200 y L葡萄糖氧化酶測試液，37°C孵育30min，于 492nm波長下測定每孔吸光度。在葡萄糖0-10mM濃度范圍內按標準曲線法計算每孔葡萄糖 含量。每孔葡萄糖消耗量=無細胞空白孔培養(yǎng)液葡萄糖含量-每孔培養(yǎng)液葡萄糖含量，每 組設3個或3個以上復孔，相同實驗重復3次。
[0033] 葡萄糖含量測定后，原培養(yǎng)孔棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含有0. 5mg/mL MTT溶液的 培養(yǎng)液，于37°C、5% C02的條件下孵育4h。棄去上清液，每孔加入100 y 1 DMS0, 37°C，振蕩 10min，于550nm波長下測定每孔的吸光度值，用于反映細胞的增殖狀況，以矯正細胞數目 差異引起的葡萄糖吸收差異。最后計算各組葡萄糖消耗量相對于模型組消耗量的百分比。 結果見圖2,五味子乙素為10 y M作用于胰島素抵抗的BNL CL. 2細胞24小時后均可增加葡 萄糖消耗量，經t檢驗，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異。本實驗中，陽性藥二甲雙胍的有效 作用濃度為ImM。五味子乙素的有效濃度為10 yM。
[0034] 實施例3
[0035] 五味子乙素對胰島素抵抗肝細胞降糖活性研究
[0036] 小鼠胚胎肝細胞BNL CL. 2用含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基于37°C、5% C02細胞培養(yǎng)箱中孵育，隔天更換新鮮培養(yǎng)液。待細胞生長至80-90%時，棄去培養(yǎng)液，加 入3mLPBS潤洗一次，加入lmL 0. 05 %胰蛋白酶-EDTA溶液消化約2min，加入三倍量培養(yǎng)液 終止消化，將細胞液900r/min離心5min，棄去上清液，加入一定量培養(yǎng)液，將細胞吹散，取 10 y L計數，將BNL CL. 2細胞接種于96孔板中，每孔2萬細胞，并設無細胞空白對照孔。培 養(yǎng)24小時后，棄去原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS)洗一遍，換上無血清無酚紅的低糖DMEM 培養(yǎng)液，分組加受試藥。
[0037] 設空白對照組（加入正常細胞培養(yǎng)液100 yL)，模型組（加入含liiM的胰島素的 細胞培養(yǎng)液100 y L)，五味子乙素組（加入含1 y M的胰島素及20 y M的五味子乙素的細胞 培養(yǎng)液1〇〇 y U，以及二甲雙胍陽性對照組（加入含1 yM的胰島素及ImM的二甲雙胍的細 胞培養(yǎng)液100 y L)。作用24小時后，用葡萄糖氧化酶法測定每孔培養(yǎng)液的葡萄糖含量，即每 孔取5 y L培養(yǎng)液于另一 96孔板中，加入200 y L葡萄糖氧化酶測試液，37°C孵育30min，于 492nm波長下測定每孔吸光度。在葡萄糖0-10mM濃度范圍內按標準曲線法計算每孔葡萄糖 含量。每孔葡萄糖消耗量=無細胞空白孔培養(yǎng)液葡萄糖含量-每孔培養(yǎng)液葡萄糖含量，每 組設3個或3個以上復孔，相同實驗重復3次。
[0038] 葡萄糖測定后，原培養(yǎng)孔棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含有0. 5mg/mL MTT溶液的培 養(yǎng)液，于37°C、5% C02的條件下孵育4h。棄去上清液，每孔加入100yl DMS0,37°C，振蕩 lOmin，于550nm波長下測定每孔的吸光度值，用于反映細胞的增殖狀況，以矯正細胞數目 差異引起的葡萄糖吸收差異。最后計算各組葡萄糖消耗量相對于模型組消耗量的百分比。
[0039] 結果見圖3,五味子乙素為20 yM作用于胰島素抵抗的BNL CL. 2細胞24小時后均 可增加葡萄糖消耗量，經t檢驗，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異。本實驗中，陽性藥二甲雙 胍的有效作用濃度為1禮。五味子乙素的有效作用濃度為20 yM。
[0040] 實施例4
[0041] l、KKAy小鼠（SPF級，雄性，6-8周），對照C57BL/6J小鼠，由北京華阜康生物科技 股份有限公司提供。所有實驗動物均適應性喂養(yǎng)10天后用于實驗。
[0042] 將高血糖KKAy小鼠隨機分成2組，分別為模型組、五味子乙素組，分組及給藥如表 1。所有小鼠每天灌胃相應劑量的藥物。對照組和模型組小鼠給予同等體積溶劑〇. 5%羧甲 基纖維素鈉溶液（0. 05% CMC-Na)。
[0043] 表1動物分組及給藥
[0044]
[0045] 2、空腹血糖測定
[0046] 給藥后每周測定一次小鼠的空腹血糖，具體操作如下：給藥后，動物禁食不禁水 6h，尾靜脈采血檢測葡萄糖水平。
[0047] 3、口服糖耐量實驗（0GIT)
[0048] 給藥4周，動物禁食過夜，采血作為Omin空腹血糖值，然后給予2g/kg葡萄糖灌胃 后，于30、60、120min三個時間點分別尾靜脈采血，檢測血糖水平，繪制糖耐量曲線，計算血 糖時間曲線下面積。
[0049] 4、結果
[0050] 空腹血糖
[0051] 實驗結果見圖4,給藥前，KKAy模型小鼠的血糖相對于對照組小鼠顯著升高，分組 后，模型組與各給藥組間無顯著差異。給藥一周，五味子乙素組空腹血糖與模型組相比顯著 降低，給藥兩周和三周后，給藥組的作用與一周后的結果類似。說明五味子乙素能較好地控 制糖尿病小鼠的血糖水平。
[0052] 口服糖耐量實驗（0GTT)
[0053] 實驗結果見圖5,給予葡萄糖2g/kg后30min、60min，五味子乙素組的血糖值低于 模型組；給予葡萄糖2g/kg后120min，五味子乙素組的血糖值顯著低于模型組（圖5A)。模 型組的口服糖耐量的曲線下面積（AUC)顯著高于對照組；相對于模型組，給藥組AUC顯著降 低。
[0054] 實施例5
[0055] 片劑制備
[0056] 五味子乙素 100g 2%羥丙甲基纖維素溶液 適量 微晶纖維素 290g 低取代甲基纖維素 6g
[0057] 硬脂酸鎂 4g
[0058] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和低取代甲基纖維素過80目篩，稱量處方量的五 味子乙素與微晶纖維素和低取代甲基纖維素混合均勻，加入2%羥丙甲基纖維素溶液適量 制粒，干燥，整粒，加入處方量的硬脂酸鎂混勻，壓片，即得1〇〇〇片。
[0059] 實施例6
[0060] 膠囊劑制備
[0061] 五味子乙素 100g 微晶纖維素 280g 交聯(lián)羧甲基纖維素鈉 Mg 微粉硅膠 6:〇g 硬脂酸鎂 4g 5%聚乙烯吡略院酮水溶液 適量
[0062] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和輔料分別過80目篩，稱量處方量的五味子乙素 與各輔料混合均勻后，加入5 %聚乙烯吡咯烷酮水溶液制軟材，制粒，干燥，整粒、加入滑石 粉，混勻，填裝膠囊即得1000粒。
【主權項】
1. 五味子乙素在制備治療糖尿病藥物中的應用。2. -種治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于，包含作為有效成分的五味子乙素。3. 如權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中五味子乙素的百 分比含量為22~25%。4. 如權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，還包括可藥用輔料。5. 如權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為口服給藥的劑型。6. 如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述口服給藥的劑型為溶液劑、片 劑、膠囊劑或顆粒劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了五味子乙素在制備治療糖尿病藥物中的應用，并提供了一種以五味子乙素為有效成分的藥物組合物，利用該藥物組合物可有效降低糖尿病患者的血糖水平，且有效作用濃度遠遠低于市場一線用藥二甲雙胍。
【IPC分類】A61P3/10, A61K31/36
【公開號】CN105168203
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】程翼宇, 王毅, 范驍輝
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月30日