,37°C，振蕩 10min，于550nm波長下測定每孔的吸光度值，用于反映細(xì)胞的增殖狀況，以矯正細(xì)胞數(shù)目 差異引起的葡萄糖吸收差異。最后計算各組葡萄糖消耗量相對于模型組消耗量的百分比。
[0026] 結(jié)果見圖1，五味子甲素組，二甲雙胍組及五味子甲素與二甲雙胍的組合物作用于 胰島素抵抗的BNL CL. 2細(xì)胞24小時后均可增加細(xì)胞的葡萄糖消耗量，經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組 比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。且ImM二甲雙胍與10 UM五味子甲素組合物的增加細(xì)胞葡萄糖消耗 量效果顯著優(yōu)于五味子甲素和二甲雙胍組（P〈〇. 001)。組合物組增加的細(xì)胞葡萄糖消耗量 大于二甲雙胍組和五味子甲素組增加的葡萄糖消耗量總和，證明二甲雙胍和五味子甲素組 合產(chǎn)生協(xié)同作用。
[0027] 實(shí)施例2
[0028] 小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL. 2用含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基于37°C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，隔天更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至80-90%時，棄去培養(yǎng)液，加入 31^?83潤洗一次，加入11^0.05%胰蛋白酶40了4溶液消化約21^11，加入三倍量培養(yǎng)液 終止消化，將細(xì)胞液900r/min離心5min，棄去上清液，加入一定量培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹散，取 10 y L計數(shù)，將BNL CL. 2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2萬細(xì)胞，并設(shè)無細(xì)胞空白對照孔。培養(yǎng) 24小時后，棄去原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS)洗一遍，換上無血清無酚紅的低糖DMEM培 養(yǎng)液，分組加受試藥。
[0029] 設(shè)空白對照組（加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液100yL)，模型組（加入含liiM的胰島素 的細(xì)胞培養(yǎng)液100 y L)，五味子甲素組（加入含1 yM的胰島素及5 yM的五味子甲素的細(xì) 胞培養(yǎng)液100 yL)，二甲雙胍組（加入含lyM的胰島素及2mM的二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液 100 yL)，以及五味子甲素與二甲雙胍的組合物組（加入含1 yM的胰島素及含有5 yM五味 子甲素+2mM二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液100 y L)。作用24小時后，用葡萄糖氧化酶法測定每孔 培養(yǎng)液的葡萄糖含量，即每孔取5 y L培養(yǎng)液于另一 96孔板中，加入200 y L葡萄糖氧化酶 測試液，37°C孵育30min，于492nm波長下測定每孔吸光度。在0-10mm〇l/L濃度范圍內(nèi)按標(biāo) 準(zhǔn)曲線法計算每孔葡萄糖含量。每孔葡萄糖消耗量=無細(xì)胞空白孔培養(yǎng)液葡萄糖含量-每 孔培養(yǎng)液葡萄糖含量，每組設(shè)3個或3個以上復(fù)孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0030] 葡萄糖含量測定后，原培養(yǎng)孔棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含有0. 5mg/mL MTT溶液的 培養(yǎng)液，于37°C、5% C02的條件下孵育4h。棄去上清液，每孔加入100 y 1 DMS0, 37°C，振蕩 10min，于550nm波長下測定每孔的吸光度值，用于反映細(xì)胞的增殖狀況，以矯正細(xì)胞數(shù)目 差異引起的葡萄糖吸收差異。最后計算各組葡萄糖消耗量相對于模型組消耗量的百分比。
[0031] 結(jié)果見圖2,5yM五味子甲素，2mM二甲雙胍作用于胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞 24小時后均可增加葡萄糖消耗量，經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。2mM二甲雙胍 與5 iiM五味子甲素組合物的增加葡萄糖消耗量效果顯著優(yōu)于5 iiM五味子甲素和2mM二甲 雙胍。而且，組合物組增加的細(xì)胞葡萄糖消耗量大于2mM二甲雙胍和5 y M五味子甲素組增 加的細(xì)胞葡萄糖消耗量總和，證明二甲雙胍和五味子甲素組合產(chǎn)生協(xié)同作用。
[0032] 實(shí)施例3
[0033] 鹽酸二甲雙胍與五味子甲素組合物片劑制備
[0034] 五味子甲素 80g 鹽酸二甲雙胍 250g 2%羥丙甲基纖維素溶液 適量 微晶纖維素 260g 低取代甲基纖維素 6g 硬脂酸鎂 4g
[0035] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和低取代甲基纖維素過80目篩，稱量處方量的五 味子甲素、鹽酸二甲雙胍與微晶纖維素和低取代甲基纖維素混合均勻，加入2%羥丙甲基纖 維素溶液適量制粒，干燥，整粒，加入處方量的硬脂酸鎂混勻，壓片，即得1〇〇〇片。
[0036] 實(shí)施例4
[0037] 鹽酸二甲雙胍與五味子甲素組合物片劑制備
[0038] 五味子甲素 160g 鹽酸二甲雙胍 500g 2%羥丙甲基纖維素溶液 適量 微晶纖維素 230g 低取代甲基纖維素 6g 硬脂酸鎂 4g
[0039] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和低取代甲基纖維素過80目篩，稱量處方量的五 味子甲素、鹽酸二甲雙胍與微晶纖維素和低取代甲基纖維素混合均勻，加入2%羥丙甲基纖 維素溶液適量制粒，干燥，整粒，加入處方量的硬脂酸鎂混勻，壓片，即得1〇〇〇片。
[0040] 實(shí)施例5
[0041] 鹽酸二甲雙胍與五味子甲素組合物膠囊劑制備
[0042] 五味子甲素 SO_g 鹽酸二甲雙狐 250g 微晶纖維素 290g 交聯(lián)羧甲基纖維素鈉 16 g 微粉硅膠 60 g 硬脂酸鎂 4g 5%聚乙烯吡咯烷酮水溶液：適量：
[0043] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和輔料分別過80目篩，稱量處方量的五味子甲 素、鹽酸二甲雙胍與各輔料混合均勻后，加入5%聚乙烯吡咯烷酮水溶液制軟材，制粒，干 燥，整粒、加入滑石粉，混勻，填裝膠囊即得1000粒。
[0044] 實(shí)施例6
[0045] 鹽酸二甲雙胍與五味子甲素組合物膠囊劑制備
[0046] 五味子甲素 160g 鹽酸二甲雙胍 500g 微晶纖維素 260g 交聯(lián)羧甲基纖維素鈉 16 g 微粉硅膠 60 g 硬脂酸鎂 4g g 5%聚乙烯吡略烷酮水溶液 適量
[0047] 制備工藝：將處方中微晶纖維素和輔料分別過80目篩，稱量處方量的五味子甲 素、鹽酸二甲雙胍與各輔料混合均勻后，加入5%聚乙烯吡咯烷酮水溶液制軟材，制粒，干 燥，整粒、加入滑石粉，混勻，填裝膠囊即得1000粒。
【主權(quán)項】
1. 一種治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于，包含作為有效成分的二甲雙胍或其可 藥用鹽和五味子甲素。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的二甲雙胍可藥用鹽為鹽酸二 甲雙胍和硫酸二甲雙胍中的一種。3. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述二甲雙胍或其可藥用鹽以二甲 雙胍計與五味子甲素的濃度比為100:1~400:1。4. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述二甲雙胍或其可藥用鹽以二甲 雙胍計的濃度為ImM~2mM。5. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述五味子甲素的濃度為5yM~ 10 yM〇6. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，包括可藥用輔料。7. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為口服給藥的劑型。8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述口服給藥的劑型為溶液劑、片 劑、膠囊劑或顆粒劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療糖尿病的藥物組合物，以二甲雙胍或其可藥用鹽和五味子甲素為有效成分。利用該藥物組合物可顯著改善胰島素抵抗，增加胰島素抵抗肝細(xì)胞的葡萄糖吸收，其效果顯著優(yōu)于任意單一成分。
【IPC分類】A61K31/09, A61P3/10, A61K31/155
【公開號】CN105168195
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】程翼宇, 范驍輝, 王毅
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月30日