專利名稱:表征生物學(xué)流體的細(xì)胞組分的方法和裝置的制作方法
本發(fā)明涉及表征生物學(xué)流體的細(xì)胞組分及定量生物學(xué)流體中的細(xì)胞群和亞群的方法，以及可以用于施行該方法的裝置。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“生物學(xué)流體”指包含細(xì)胞組分或可能包含此類組分的任何天然流體或生物制品，例如血液、骨髓、腦脊液、胸膜液，和術(shù)語“細(xì)胞組分”指任何在其最傳統(tǒng)意義上的細(xì)胞，例如紅細(xì)胞和白細(xì)胞，以及存在于生物學(xué)流體中的任何其他細(xì)胞類型，例如血小板。同樣地，術(shù)語“群體”指同一類別的一組細(xì)胞，例如，嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，和術(shù)語“亞群”指同一類型的一亞組特殊細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞群的B、T4、T8淋巴細(xì)胞等，但還指未成熟或變化的形式。
確定并計(jì)數(shù)在不同生物學(xué)流體例如血液中的全部細(xì)胞群，在臨床診斷方面具有非常大的重要性。生物學(xué)流體的細(xì)胞學(xué)分析的傳統(tǒng)方法利用各種常規(guī)設(shè)備例如基于流式細(xì)胞術(shù)的血液學(xué)自動(dòng)裝置，其用于區(qū)分并精確地自動(dòng)計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的所有細(xì)胞，所述細(xì)胞隨后可以進(jìn)行分群。這些設(shè)備通常包括一般為電學(xué)和/或光學(xué)測量裝置的測量裝置，其與可能存在的各種不同的試劑和染色劑相容，產(chǎn)生如上所述的分析結(jié)果。因此，對(duì)于血液樣品，這些自動(dòng)裝置使得能夠形成血像，它提供血細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)的常規(guī)參數(shù)。利用相互不同的另外設(shè)備，可以獲得關(guān)于網(wǎng)織紅細(xì)胞、成紅細(xì)胞、未成熟細(xì)胞等的鑒定的補(bǔ)充結(jié)果以便補(bǔ)全全部血像數(shù)據(jù)。例如，可以參考由本申請(qǐng)人提交的專利申請(qǐng)F(tuán)R0102489，它涉及通過利用流式細(xì)胞術(shù)的多參數(shù)測量方法來鑒定并計(jì)數(shù)生物細(xì)胞的方法和試劑。
因此可以由此推斷出關(guān)于每種生物細(xì)胞種類的信息，從而產(chǎn)生其分類。
在絕大多數(shù)情況下，所有細(xì)胞組分的精確自動(dòng)化計(jì)數(shù)及每種細(xì)胞組分群體的區(qū)分足以給從業(yè)醫(yī)師提供關(guān)于存在細(xì)胞學(xué)失調(diào)或紊亂的信息。然而，當(dāng)利用常規(guī)細(xì)胞學(xué)分析自動(dòng)裝置分析生物學(xué)流體時(shí)，與正常期望的那些相比，某些異常的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果可以驗(yàn)證額外的調(diào)查以便改善一個(gè)或多個(gè)這些結(jié)果。此外，此類分析不能使得能夠精確定量同一群體或家族中的不同細(xì)胞群，這是一個(gè)很大的缺點(diǎn)，特別是對(duì)于檢測患者中的某些病理學(xué)狀況或?qū)τ诒O(jiān)測其發(fā)展。
因此補(bǔ)充分析被證實(shí)對(duì)于獲得血液樣品中的所選細(xì)胞(例如白細(xì)胞)亞群的計(jì)數(shù)的更精確結(jié)果來說是必需的。某些病理學(xué)狀況(免疫反應(yīng)或白血病)的出現(xiàn)可以與白細(xì)胞類型的細(xì)胞群的異常水平相關(guān)。
這種補(bǔ)充分析與利用常規(guī)自動(dòng)裝置進(jìn)行的那些不同，其可以是進(jìn)行手工涂片隨后在顯微鏡下觀察。在這種情況下，細(xì)胞組分的鑒定和計(jì)數(shù)一般用于對(duì)由自動(dòng)裝置獲得的那些進(jìn)行補(bǔ)充或替代。
它們還可以由特異性細(xì)胞標(biāo)記組成，所述細(xì)胞標(biāo)記通過被選擇用于區(qū)別經(jīng)標(biāo)記的所選細(xì)胞群的抗體(可選地包括熒光染料)來進(jìn)行，或通過本領(lǐng)域已知的任何其他標(biāo)記方法來進(jìn)行。例如，可以提及專利申請(qǐng)EP0552707，它公開了利用例如抗-CD45和抗-CD71單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，以便在流式細(xì)胞儀中區(qū)分所有白細(xì)胞。專利申請(qǐng)WO00/16103描述了通過利用抗體或抗體試劑盒進(jìn)行區(qū)別并經(jīng)熒光測量術(shù)進(jìn)行檢測來定量嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。同樣地，用抗-CD19、抗-CD14和抗-CD8抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞群使得能夠分別分開B淋巴細(xì)胞、T輔助淋巴細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞(T Suppressor)的亞群。
盡管這些分析使得能夠監(jiān)督和/或校正由常規(guī)自動(dòng)裝置獲得的結(jié)果，但它們經(jīng)常導(dǎo)入不準(zhǔn)確度并只允許與經(jīng)自動(dòng)裝置獲得的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。使用更高效的方法例如流式細(xì)胞術(shù)幾乎產(chǎn)生相同的結(jié)果，但與利用自動(dòng)裝置獲得的結(jié)果直接相關(guān)是不可能的，因?yàn)檫M(jìn)行的是兩種分開的分析，這降低了全部結(jié)果的準(zhǔn)確性。
實(shí)際上，當(dāng)生物學(xué)流體的等分試樣中的細(xì)胞組分的分析揭示所述細(xì)胞組分的精確計(jì)數(shù)中的異常時(shí)，使用者利用兩種獨(dú)立的分析系統(tǒng)對(duì)同一生物學(xué)流體的不同等分試樣進(jìn)行第二個(gè)獨(dú)立分析，因此在分開的基礎(chǔ)上進(jìn)行測量，即，每次測量提供不同的結(jié)果，這因而需要通過每次測量獲得的結(jié)果的數(shù)學(xué)相關(guān)性以便最終獲得具有誤差的結(jié)果。這導(dǎo)致具有主觀性的結(jié)果解釋，因?yàn)樗辉试S可靠地鑒定異常結(jié)果的真實(shí)原因，所述異常結(jié)果可以是由于樣品自身或設(shè)備所引起的，并且還可以顯示是病理學(xué)狀況的精確診斷(如果需要的話)所不能接受的。
本發(fā)明提出了現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的補(bǔ)救。
為此目的，本發(fā)明提出了區(qū)分并計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的細(xì)胞組分的方法，包括-一般通過流式細(xì)胞術(shù)施行的初步細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得一組初步結(jié)果，使得能夠?qū)悠分械乃屑?xì)胞組分區(qū)分成不同的群體并計(jì)數(shù)；以及-基于所鑒定的細(xì)胞特性，對(duì)特定類型細(xì)胞組分進(jìn)行補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得補(bǔ)充結(jié)果，使得能夠區(qū)分并計(jì)數(shù)樣品的至少一種細(xì)胞群或亞群從而鑒定所述細(xì)胞特性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括對(duì)生物學(xué)流體或生物學(xué)流體等分試樣進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)分析的第一個(gè)步驟，其通常通過流式細(xì)胞儀來施行，包括電學(xué)和/或光學(xué)類型的測量手段(moyen)和試劑，所述試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞裂解劑、細(xì)胞內(nèi)材料的染色劑、水性稀釋劑及其混合物。來自上述測量手段的信號(hào)通常進(jìn)行處理并轉(zhuǎn)化為“標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果”，即，整合了分析常規(guī)參數(shù)的一組結(jié)果。因此這使得能夠鑒定細(xì)胞組分并精確計(jì)數(shù)，這些細(xì)胞組分隨后被分為不同群，如在例如專利申請(qǐng)F(tuán)R9701090中所述的。
第二個(gè)步驟，或補(bǔ)充步驟，使得能夠獲得補(bǔ)充結(jié)果，這些補(bǔ)充結(jié)果使得能夠鑒定細(xì)胞特性。
關(guān)于特定種類的細(xì)胞組分或關(guān)于多個(gè)群體的異常計(jì)數(shù)結(jié)果使得能夠鑒定一種或多種異常。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，這些異常可以例如與異常高數(shù)目的胚細(xì)胞或異常結(jié)構(gòu)的淋巴細(xì)胞相關(guān)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，首先施行單獨(dú)的初步步驟，并且如果初步結(jié)果允許鑒定至少一種與所鑒定的細(xì)胞特性相關(guān)的異常，那么同時(shí)施行被重復(fù)以重新獲得該組初步結(jié)果的初步步驟和用于獲得與這種細(xì)胞特性相關(guān)的補(bǔ)充結(jié)果的補(bǔ)充步驟。
有利地，所述方法進(jìn)一步包括基于所鑒定的細(xì)胞特性的特異性細(xì)胞標(biāo)記步驟，隨后為細(xì)胞學(xué)分析步驟，這使得能夠獲得用于鑒定樣品中包含的所有群體的全部初步結(jié)果以及用于鑒定與所鑒定的細(xì)胞特性相關(guān)的群體或亞群的補(bǔ)充結(jié)果。
因此，這些特性產(chǎn)生特殊類型細(xì)胞組分的特異性標(biāo)記步驟，例如血液中的淋巴細(xì)胞的亞群，它在血液等分試樣中的數(shù)目與正常預(yù)期的相比是異常的，因此驗(yàn)證了更深入的研究，用于區(qū)分并計(jì)數(shù)這種特殊群體以便嘗試確定其不同的亞群。
因此，一旦進(jìn)行細(xì)胞組分標(biāo)記，那么必需揭示被特異性標(biāo)記的細(xì)胞組分，或者需要時(shí)，揭示未被標(biāo)記的那些。這通過施行補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)測量步驟來完成，所述補(bǔ)充步驟導(dǎo)致用于定量并區(qū)分細(xì)胞群或亞群細(xì)胞組分的額外結(jié)果，所述細(xì)胞群或亞群細(xì)胞組分是與它們的數(shù)目或它們的存在相關(guān)的異常的根源。如已提及的，操作者施行與經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞組分的補(bǔ)充步驟相關(guān)聯(lián)并且同時(shí)的初步分析的重復(fù)分析。因此，這些補(bǔ)充測量的結(jié)果聯(lián)合對(duì)于相同生物學(xué)流體等分試樣而獲得的初步分析步驟的重復(fù)結(jié)果為目標(biāo)亞群提供了區(qū)分和計(jì)數(shù)結(jié)果，所述結(jié)果建立在與使得能夠建立標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果的那個(gè)等同的參照基礎(chǔ)上。因此消除了在連續(xù)分析中、在不同分析方法中、在未整合的設(shè)備中所固有的所有誤差或不精確。
因此，可以對(duì)于相同細(xì)胞組分測量不同的物理化學(xué)特征，特別是利用由于其對(duì)至少一種物理化學(xué)特征特異的親和力而選擇出的標(biāo)記物，例如細(xì)胞內(nèi)材料(DNA、RNA)、特殊蛋白或酶、膜結(jié)構(gòu)等。這使得能夠區(qū)分每種經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞組分與未標(biāo)記的細(xì)胞組分。因此，隨后通過已知方法檢測經(jīng)標(biāo)記的或未標(biāo)記的細(xì)胞組分(參見下文)。同樣地，細(xì)胞標(biāo)記使得能夠非常精確地定量細(xì)胞組分的不同亞群，例如淋巴細(xì)胞群的B、T4、T8淋巴細(xì)胞等。
因此，在同一生物學(xué)流體樣品中，施行根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠表征與對(duì)于某些病理學(xué)狀況來說特有的某些細(xì)胞組分存在相關(guān)或與其異常低或高的數(shù)目相關(guān)的特性。因此，允許在確定的群體或亞群中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)研究。根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠?yàn)榫哂幸郧皬奈催_(dá)到的精確度和可靠性的結(jié)果提供可能性，因?yàn)閷?duì)應(yīng)這些可能性的補(bǔ)充分析與導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果的分析同時(shí)并聯(lián)合進(jìn)行，由此確保存在所有補(bǔ)充結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果所共有的參照基礎(chǔ)，并由此特別消除了分開的分析的所有缺點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的方法還使得能夠消除對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果所觀察到的偏差的最大多數(shù)的解釋誤差(erreur d′interprétation)，作為異常這可以接受標(biāo)準(zhǔn)化的系統(tǒng)處理。
根據(jù)本發(fā)明的方法在單次施行中產(chǎn)生完整和總體的結(jié)果，這避免了需要依靠連續(xù)、多次和分開的分析，這樣的分析可能是從業(yè)醫(yī)師為了獲得精確的病理狀況診斷而要求的。這個(gè)的優(yōu)點(diǎn)在于它降低了與這些分析有關(guān)的成本。
相似地，在鑒定了病理狀況以為了監(jiān)控其發(fā)展或治療有效性的情況下，從業(yè)醫(yī)師有更大的選擇來以保證一組與唯一參照基礎(chǔ)相關(guān)的結(jié)果的可靠性的方式來規(guī)定待施行的分析。
最后，根據(jù)本發(fā)明的方法在檢測并表征標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果的細(xì)胞特性方面給了從業(yè)醫(yī)師更大的可靠性。
初步細(xì)胞學(xué)分析步驟有利地包括利用第一種測量手段，其使得能夠通過至少一種電學(xué)區(qū)分手段或光學(xué)區(qū)分手段來區(qū)分樣品中存在的所有細(xì)胞組分，所述電學(xué)區(qū)分手段包括阻抗，所述光學(xué)區(qū)分手段包括衍射、漫射、透射和熒光。
此外，這個(gè)初步步驟可以包括利用使得能夠區(qū)分樣品中存在的所有細(xì)胞組分的一種或多種試劑。
補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟有利地包括利用第二種測量手段，其使得能夠區(qū)分和計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的至少一種細(xì)胞群或亞群。
第二種測量手段優(yōu)選包括利用至少一種光學(xué)區(qū)分手段。因此，這些第二種測量手段優(yōu)選包括一種或多種測量通道(canal)，所述測量通道以光學(xué)方式運(yùn)作并能夠以單一或組合方式測量選自衍射、透射、熒光或吸光度的光學(xué)參數(shù)，特別是在某些波長處或波長范圍內(nèi)。
第二種測量手段可以由至少一種測量途徑組成，所述測量途徑以熒光方式運(yùn)作并利用一個(gè)或多個(gè)合理選擇的波長。特別地，第二種測量手段在選自從紫外到紅外的波長上是可有效運(yùn)作的。
優(yōu)選地，特異性細(xì)胞標(biāo)記步驟包括利用至少一種使得能夠區(qū)分所述細(xì)胞特性的標(biāo)記物，而補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟包括利用第二種測量手段，它包括至少一種能夠與該組測量同時(shí)地鑒定標(biāo)記物的測量途徑。
測量信號(hào)的處理可以利用計(jì)算機(jī)來進(jìn)行，所述計(jì)算機(jī)包括用于處理數(shù)據(jù)和重建結(jié)果的適當(dāng)手段。這些手段可以為兩個(gè)計(jì)算軟件，其中一個(gè)用于處理信號(hào)以便提供結(jié)果的圖形顯示，和另一個(gè)用于處理由結(jié)果分析獲得的信號(hào)。計(jì)算機(jī)可以與指導(dǎo)特異性細(xì)胞標(biāo)記步驟的控制手段相連。
為了施行標(biāo)記步驟，可以利用至少一種為分子探針的細(xì)胞標(biāo)記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
作為標(biāo)記物而選擇出的染色劑必須與預(yù)定測量中的細(xì)胞內(nèi)材料的染色劑不同，即它必須能夠通過光學(xué)測量技術(shù)在與對(duì)于檢測預(yù)定測量中的染色劑所需的波長不同的波長上被檢測。
采用至少一種抗體或抗體混合物或抗體試劑盒的標(biāo)記通常通過抗原/抗體反應(yīng)來施行，其優(yōu)選利用單克隆抗體來進(jìn)行，所述單克隆抗體有利地接合了常規(guī)染色劑或熒光染料，例如熒光素或藻紅蛋白-花青苷5(PC5)。
此外，對(duì)于分析步驟，電學(xué)和光學(xué)類型的測量手段分別為直流電或交流電的細(xì)胞阻抗測量手段，以及選自光衍射、光漫射、光透射或熒光的測量手段。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，生物學(xué)流體優(yōu)選為稀釋或未稀釋的全血、血清、稀釋或未稀釋的骨髓、腦脊液、尿液、滑液、胸膜液等。
當(dāng)生物學(xué)流體樣品為血液樣品時(shí)，初步細(xì)胞學(xué)分析步驟有利地包括產(chǎn)生血像所需的測量，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)的全部或部分參數(shù)。
在這種情況下，可以利用特異性抗體來標(biāo)記血液樣品的細(xì)胞組分，這些抗體選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板群體。因此，可以通過在紅細(xì)胞上進(jìn)行靶向標(biāo)記并連同在白細(xì)胞或血小板上進(jìn)行靶向標(biāo)記來施行根據(jù)本發(fā)明的方法，在分析中沒有彼此相互作用和干擾的風(fēng)險(xiǎn)。
標(biāo)記步驟有利地利用特異性抗體來進(jìn)行，所述特異性抗體用于在血液樣品細(xì)胞群中存在的至少一種特殊亞群的細(xì)胞標(biāo)記。
優(yōu)選地，標(biāo)記步驟通過利用用于標(biāo)記至少一種亞群的特異性抗體來進(jìn)行，所述亞群選自淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及其所有前體。
細(xì)胞標(biāo)記步驟可以通過至少一種與熒光染料綴合的抗體或抗體混合物來進(jìn)行，和補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟采用通過正交(orthogonal)熒光類型(FL2)的細(xì)胞熒光的測量手段。
細(xì)胞標(biāo)記步驟有利地通過至少一種選自下列的抗體來進(jìn)行CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。
細(xì)胞標(biāo)記步驟還可以利用至少一種為分子探針的細(xì)胞標(biāo)記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，初步細(xì)胞學(xué)分析步驟以及補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟同時(shí)測量同一流中的相同細(xì)胞組分的不同物理特征。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括下述步驟將試劑和細(xì)胞標(biāo)記物與生物學(xué)流體混合，并將由此獲得的混合物轉(zhuǎn)移到分析池中，這使得能夠?qū)τ谙嗤飳W(xué)流體或生物學(xué)流體等分試樣進(jìn)行總體和同時(shí)的分析，如上文所解釋的。
根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠例如為血液樣品建立完整的血像，即超越標(biāo)準(zhǔn)化系列結(jié)果并包括血液中細(xì)胞群的區(qū)分和計(jì)數(shù)的詳細(xì)鑒定，所述細(xì)胞群即淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞、成紅細(xì)胞、未成熟的顆粒細(xì)胞、血小板及其他胚細(xì)胞，并且在如果需要時(shí)還有可能檢測和計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞群中的異常胚細(xì)胞亞群，它不具有與所預(yù)期的一致的淋巴細(xì)胞分布。例如，這些淋巴母細(xì)胞根據(jù)其對(duì)抗-CD45抗體的非陽性而與其他淋巴細(xì)胞群分離。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及施行上述方法的裝置，該裝置包括以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行運(yùn)作的設(shè)備，具有第一種測量手段，包括至少一種能夠測量選自光學(xué)參數(shù)和電學(xué)參數(shù)的參數(shù)的測量通道，所述光學(xué)參數(shù)選自衍射、漫射、透射和熒光，以及所述電學(xué)參數(shù)包括阻抗；第二種分析手段，包括至少一種能夠測量選自衍射、透射、熒光和吸光度的光學(xué)參數(shù)的測量通道；以及用于處理從第一種測量手段和第二種測量手段獲得的結(jié)果的計(jì)算機(jī)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種測量手段包括軸向衍射(FSC)的傳感器、正交漫射(SSC)的傳感器、正交熒光(FL1)的傳感器和用于測量電阻率的電極，以及所述第二種測量手段包括用于測量正交熒光(FL2)的傳感器。
因此，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包括整合到流式細(xì)胞儀中的預(yù)定的第一種常規(guī)分析手段。有利地，這些手段為生物學(xué)流體樣品或等分試樣的至少一種選自軸衍射(FSC)、正交漫射(SSC)、正交熒光(FL1)和電阻率(RES)的測量或通道參數(shù)，如申請(qǐng)人在專利申請(qǐng)EP0425381中所描述的。因此，這些第一種分析手段導(dǎo)致細(xì)胞組分的區(qū)分及其精確計(jì)數(shù)，使得能夠?qū)⑵溥M(jìn)行分群。
有利地，如申請(qǐng)人在專利申請(qǐng)F(tuán)R0102489中所述的，初步手段被布置用于引入至少一種用于區(qū)分并計(jì)數(shù)生物學(xué)流體的所有細(xì)胞組分的試劑，所述試劑選自細(xì)胞裂解劑、細(xì)胞內(nèi)材料的染色劑、水性稀釋劑及其混合物。
例如利用離子型和/或非離子型去污劑來進(jìn)行生物學(xué)流體的某些細(xì)胞組分特別是紅細(xì)胞的裂解，所述去污劑可以為伯胺、膽酰胺等。裂解劑的選擇取決于生物學(xué)流體的性質(zhì)，并且將因此可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員來決定。
細(xì)胞組分的染色劑用于與細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA結(jié)合。它通?？梢詾猷邕虺?、噻唑藍(lán)等。所述試劑可以任選包括細(xì)胞組分的固定劑(agentde fixation)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案，其進(jìn)一步包括-至少一種細(xì)胞特性的鑒定手段，其對(duì)應(yīng)于某些細(xì)胞群或某些細(xì)胞組分的存在或數(shù)目的，-根據(jù)所鑒定的特性的特異性細(xì)胞標(biāo)記手段。
所述標(biāo)記手段優(yōu)選包括至少一種為分子探針的細(xì)胞標(biāo)記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體，并且更優(yōu)選地，它們?yōu)槠渖辖雍嫌袩晒馊玖系闹辽僖环N抗體或抗體混合物。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案，適合于所述標(biāo)記手段為一種或多種測量通道，其分別為直流電或交流電的細(xì)胞阻抗測量手段以及選自在從紫外到紅外波長上經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞的衍射、光透射和熒光或吸光度的至少一種測量手段。
優(yōu)選地，通過細(xì)胞熒光的測量手段為接合在特異性抗體上的熒光染料的正交熒光(FL2)。
根據(jù)本發(fā)明的裝置的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，它包括計(jì)算機(jī)，其被布置用于將來自第一種測量手段和第二種測量手段的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，并形成來自第一種測量手段和第二種測量手段的結(jié)果的圖形。
有利地，計(jì)算機(jī)被布置用于根據(jù)其家族或其物理特征對(duì)所述細(xì)胞組分進(jìn)行解釋和分類。
如上所述，計(jì)算機(jī)被布置用于處理測量信號(hào)，并進(jìn)一步包括處理數(shù)據(jù)和重建結(jié)果的適當(dāng)手段。它優(yōu)選包括儲(chǔ)存通過各種分析獲得的結(jié)果的存儲(chǔ)器。
可以想象，在涉及施行這樣的分析是否適當(dāng)時(shí)，此類設(shè)備可以具有自動(dòng)決策能力，所述分析是對(duì)常規(guī)分析的補(bǔ)充，是鑒定和計(jì)數(shù)被搜尋或被懷疑應(yīng)對(duì)所揭示的異常負(fù)責(zé)的成分所必需的。
本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)由于下文中的詳細(xì)描述以及由于非限制性實(shí)施例將變得更為明顯，其中參考其后所附的圖，其中
-圖1顯示構(gòu)成根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的分析設(shè)備的具體元件(élément)的圖；-圖2-19顯示通過多參數(shù)測量法FSC、RES、SSC、FL1和FL2而獲得的細(xì)胞分布或二維矩陣的圖。
在圖1中，以功能圖的形式顯示了組成根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備1的具體元件，所述設(shè)備1用于分析生物學(xué)流體等分試樣。該圖部分地采用了專利申請(qǐng)F(tuán)R0102489中所描述的參數(shù)。設(shè)備1是基于流式細(xì)胞術(shù)的自動(dòng)裝置，其具有下述參數(shù)和元件-單色激光10，-用于形成光束的裝置11，-通過電阻率和通過光學(xué)測量來測量細(xì)胞體積的循環(huán)池12，-用于收集軸向衍射(FSC)的輻射的光學(xué)系統(tǒng)13，-提供大小解釋的軸向衍射(FSC)的傳感器14，-表示所觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的正交漫射(SSC)的傳感器15，-測量細(xì)胞內(nèi)RNA和DNA表達(dá)的正交熒光(FL1)的傳感器16，-測量與熒光染料接合的抗體的反應(yīng)性的正交熒光(FL2)的傳感器17，-用于收集正交輻射的光學(xué)系統(tǒng)18，-整合在池12中的電阻率(RES)測量電極19，-計(jì)算機(jī)20，-顯示結(jié)果的系統(tǒng)21。
在包括光學(xué)測量通道的設(shè)備1上分析生物學(xué)流體等分試樣，通過細(xì)胞的軸向衍射、正交漫射和正交熒光來進(jìn)行，其原理在下文中得到簡要闡述。
在第一種情況下，將生物學(xué)流體的細(xì)胞置于測量池12中并且被由源10發(fā)出并經(jīng)設(shè)備11調(diào)整的光輻射穿透，這些細(xì)胞引起入射輻射的衍射，其強(qiáng)度取決于細(xì)胞的大小。用于收集衍射輻射的光學(xué)系統(tǒng)13被放置成與輻射在一直線上。被衍射的輻射在傳感器14上收集，其響應(yīng)取決于細(xì)胞衍射。
正交漫射的原理基于測量穿過細(xì)胞組分的光輻射的漫射。輻射在傳感器15上被收集并且響應(yīng)與漫射成正比，所述傳感器15與在池12的出口處漫散的輻射成直角。
正交熒光FL1和FL2的測量分別基于這樣的原理，即染色細(xì)胞在特定波長上激發(fā)而發(fā)射出具有不同于激發(fā)波長的波長的熒光輻射，而接合在特異抗體上的熒光染料的激發(fā)反過來又發(fā)射出特定的熒光輻射。
用于收集正交輻射FL1和FL2的光學(xué)系統(tǒng)18被放置成與由輻射源10所發(fā)射的輻射成直角。
設(shè)備1還包括通過電阻率(RES)的電學(xué)測量通道。這種測量基于下述原理，在其中電流是恒定的電場中，將待測物(élément)放置在池12中，根據(jù)歐姆定律該電場中由這個(gè)待測物呈現(xiàn)的電阻率導(dǎo)致維持恒流所需的電壓增加。
整合在池12中的電極19測量元件的電阻率，從而使得能夠評(píng)測其體積。
實(shí)施例1如專利申請(qǐng)F(tuán)R 0102489所述，在基于流式細(xì)胞術(shù)的常規(guī)自動(dòng)分析裝置上分析一等分試樣的正常血液以便表征和定量白細(xì)胞成分(élément)。
以二維矩陣的形式觀察這種分析的結(jié)果，所述二維矩陣代表從每種測量通道獲得的測量結(jié)果的不同組合。為了清晰起見，每個(gè)矩陣中代表每種細(xì)胞成分的點(diǎn)已被省去。只有界定所獲得的每個(gè)群體的輪廓線被畫出。
圖2顯示了通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到4個(gè)群體L為淋巴細(xì)胞、M為單核細(xì)胞、E為嗜酸性粒細(xì)胞和N為嗜中性粒細(xì)胞。在這個(gè)圖2中，群體N和E沒有明顯分開。
圖3顯示了通過兩種通道FSC和FL1獲得的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L和M之間存在部分重疊。
圖4顯示了通過測量通道SSC和FL1形成的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L和M互相完全分開。
圖5也顯示了通過兩種通道RES和FSC形成的矩陣，根據(jù)這個(gè)安排，群體L和E是分開的，但群體N和M沒有分開。
實(shí)施例2利用專利申請(qǐng)F(tuán)R 0102489中所述的測量通道，在基于流式細(xì)胞術(shù)的常規(guī)自動(dòng)分析裝置上分析一等分試樣的血液以便表征和定量白細(xì)胞組分。
圖6顯示了利用兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。盡管群體L和N具有與圖2中的外形相似的外形，但群體L與圖2中所示的正常的那種相比異常擴(kuò)展。這還可以在圖7-9中看出，所述圖7-9分別對(duì)應(yīng)于圖3-5中的矩陣視圖。在這些分析結(jié)束時(shí)，看起來可能的是，在圖中的分布比正常淋巴細(xì)胞群的分布更為擴(kuò)展的淋巴細(xì)胞群具有異常的細(xì)胞成分例如胚細(xì)胞成分。
實(shí)施例3利用設(shè)備1根據(jù)本發(fā)明的方法分析一等分試樣的實(shí)施例2的血液。
該分析如下進(jìn)行抽取50μl的人類血液樣品等分試樣，將其與包含PC5作為熒光染料的50μl抗-CD45單克隆抗體溶液混合。將由此獲得的溶液在沒有任何光輻射的情況下并在環(huán)境溫度下孵育數(shù)分鐘，大約3-30分鐘。由此獲得的溶液隨后與包含噻唑橙作為細(xì)胞內(nèi)染色劑的試劑混合以裂解紅細(xì)胞并固定細(xì)胞成分，這是進(jìn)行初步分析步驟所必需的。
在這種情況下，利用激光10發(fā)出的噻唑橙的激發(fā)波長為488nm，和發(fā)射波長為530nm。在這個(gè)實(shí)施例中，抗-CD45抗體用于特異性標(biāo)記成熟且正常的白細(xì)胞，以表達(dá)減少的順序?yàn)榱馨图?xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。
隨后將溶液轉(zhuǎn)移到分析設(shè)備1的循環(huán)池12中。使用者開始以四個(gè)通道來分析等分試樣從而提供用于區(qū)分和計(jì)數(shù)不同細(xì)胞群的常規(guī)結(jié)果，并且利用計(jì)算機(jī)20以第五個(gè)通道FL2(PC5的激發(fā)波長為488nm，和發(fā)射波長為660nm)同時(shí)進(jìn)行分析。軟件處理來自通過上述通道的每種測量的結(jié)果。
圖10顯示通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到5個(gè)群體L為淋巴細(xì)胞、M為單核細(xì)胞、E為嗜酸性粒細(xì)胞和B為對(duì)于抗-CD45抗體來說是陰性的胚細(xì)胞。
在該圖10中，群體N和E沒有明顯分開，并且在群體L、M和B之間可以觀察到部分重疊。
圖11顯示通過兩種通道FSC和FL1獲得的矩陣。群體N和E混在一起，并且群體L、M和B之間存在部分重疊。
圖12顯示通過測量通道SSC和FL1而形成的矩陣。群體N和E同樣也混在一起，并且盡管群體M與其他群體分開，但是可以看出群體B和L沒有完全分開。
圖13也顯示了通過兩種通道RES和FSC而形成的矩陣。在這個(gè)安排中，存在的群體沒有一個(gè)明顯地分開。
圖14顯示通過兩種通道FL2和SSC而形成的矩陣。這個(gè)矩陣視圖使得能夠分開異常胚細(xì)胞群B與淋巴細(xì)胞群。
通過利用設(shè)備1施行根據(jù)本發(fā)明的方法，使得能夠表征和定量在所分析的血液等分試樣中胚細(xì)胞B(對(duì)于抗-CD45來說為陰性)的存在。圖14中顯示的補(bǔ)充測量使得能夠明確區(qū)分胚細(xì)胞B，這用血像的所有預(yù)定測量是不可能實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例4這個(gè)實(shí)施例用于提供血液樣品中非胚性細(xì)胞組分的精確計(jì)數(shù)，所述血液樣品中的胚細(xì)胞群在監(jiān)控對(duì)于患者的治療的范圍內(nèi)是已知的。先前的分析已顯示了淋巴細(xì)胞群的異常分布，驗(yàn)證了補(bǔ)充的檢查。
隨后的分析用于鑒定淋巴細(xì)胞成分以對(duì)它們進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。
這個(gè)鑒定將利用與相同熒光染料PC5綴合的抗-CD19和抗-CD3抗體并且通過經(jīng)通道FL2檢測標(biāo)記的淋巴細(xì)胞來完成。
在早先所述的設(shè)備1上就已知的胚細(xì)胞群體分析50μl的血液等分試樣，并對(duì)其實(shí)施實(shí)施例3中所述分析步驟和試劑。
圖15顯示通過兩種通道FSC和SSC獲得的矩陣。觀察到3個(gè)群體L為對(duì)于經(jīng)抗-CD3和抗-CD19標(biāo)記來說為陽性的淋巴細(xì)胞，N為嗜中性粒細(xì)胞和B為對(duì)于這兩種抗體來說為陰性的淋巴細(xì)胞成分。群體N并非與其他兩種群體L和B完全不同，所述群體L和B被觀察到有一定程度的群體間重疊。這還可以在圖16-18中被看出，所述圖16-18分別對(duì)應(yīng)于根據(jù)圖3-5中的安排的矩陣視圖。
圖19顯示通過兩種通道FL2和SSC形成的矩陣。這個(gè)矩陣視圖使得能夠分開所考慮的3個(gè)群體，并且特別是在整個(gè)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中分開對(duì)于抗-CD3和抗-CD19來說為陽性的淋巴細(xì)胞與陰性的淋巴細(xì)胞，從而使得能夠進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。圖19中顯示的補(bǔ)充測量使得能夠明確區(qū)分對(duì)于CD3抗體和對(duì)于CD19抗體來說為陽性的淋巴細(xì)胞，這用血像的所有預(yù)定測量是不可能實(shí)現(xiàn)的。
權(quán)利要求
1.區(qū)分并計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的細(xì)胞組分的方法，其特征在于，所述方法包括-一般通過流式細(xì)胞術(shù)施行的初步細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得一組初步結(jié)果，使得能夠?qū)悠分械乃屑?xì)胞組分區(qū)分成不同的群體并計(jì)數(shù)，以及-基于所鑒定的細(xì)胞特性，對(duì)特定類型細(xì)胞組分進(jìn)行補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得補(bǔ)充結(jié)果，使得能夠區(qū)分并計(jì)數(shù)樣品的至少一種細(xì)胞群或亞群從而鑒定所述細(xì)胞特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其特征在于，首先施行單獨(dú)的初步步驟，并且如果初步結(jié)果允許鑒定至少一種與所鑒定的細(xì)胞特性相關(guān)的異常，則隨后同時(shí)施行被重復(fù)以重新獲得該組初步結(jié)果的初步步驟和用于獲得與這種細(xì)胞特性相關(guān)的所述補(bǔ)充結(jié)果的補(bǔ)充步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括基于所鑒定的細(xì)胞特性的特異性細(xì)胞標(biāo)記步驟，隨后為細(xì)胞學(xué)分析步驟，這使得能夠獲得用于鑒定樣品中包含的所有群體的該組初步結(jié)果以及用于鑒定與所鑒定的細(xì)胞特性相關(guān)的群體或亞群的補(bǔ)充結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述初步細(xì)胞學(xué)分析步驟包括利用第一種測量手段，所述第一種測量手段使得能夠通過至少一種電學(xué)區(qū)分手段或光學(xué)區(qū)分手段來區(qū)分在所述樣品中存在的所有細(xì)胞組分，所述電學(xué)區(qū)分手段包括阻抗，和所述光學(xué)區(qū)分手段包括衍射、漫射、透射和熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其特征在于，所述初步細(xì)胞學(xué)分析步驟包括使用使得能夠區(qū)分在所述樣品中存在的所有細(xì)胞組分的一種或多種試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟包括利用第二種測量手段，所述第二種測量手段使得能夠區(qū)分并計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的至少一種細(xì)胞群或亞群。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其特征在于，所述第二種測量手段包括使用至少一種光學(xué)區(qū)分手段。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其特征在于，所述第二種測量手段包括一種或多種測量途徑，所述測量途徑以光學(xué)方式運(yùn)作并能夠以單一或組合方式測量選自衍射、透射、熒光或吸光度的光學(xué)參數(shù)，特別是在某些波長處或波長范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其特征在于，所述第二種測量手段由至少一種測量途徑組成，所述測量途徑以熒光方式運(yùn)作并利用一個(gè)或多個(gè)合理選擇的波長。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其特征在于，通過以熒光方式運(yùn)作的所述第二種測量手段在選自從紫外到紅外的波長上是可有效運(yùn)作的。
11.根據(jù)組合在一起的權(quán)利要求
3和6的方法，其特征在于，所述特異性細(xì)胞標(biāo)記步驟包括利用至少一種使得能夠區(qū)分所述細(xì)胞特性的標(biāo)記物，和所述補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟包括利用第二種測量手段，它包括至少一種能夠與該組測量同時(shí)地鑒定標(biāo)記物的測量途徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1-11中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物學(xué)流體樣品選自下列-稀釋或未稀釋的全血或非全血，-血清，-稀釋或未稀釋的骨髓，-腦脊液，-尿液，-滑液，-胸膜液。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1-12中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物學(xué)流體樣品為血液樣品，和所述初步細(xì)胞學(xué)分析步驟包括產(chǎn)生血像所需的測量，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)的全部或部分參數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求
3-13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物學(xué)流體樣品為血液樣品，和所述細(xì)胞標(biāo)記步驟包括利用用于標(biāo)記血液樣品的細(xì)胞組分的特異性抗體，這些抗體選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板群體。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)記步驟包括利用特異性抗體，其用于進(jìn)行在所述血液樣品的細(xì)胞群中存在的至少一種特殊亞群的細(xì)胞標(biāo)記。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14和15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)記步驟包括利用用于標(biāo)記至少一種亞群的特異性抗體，所述亞群選自淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及其所有前體。
17.根據(jù)權(quán)利要求
3-16中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)記步驟通過至少一種與熒光染料綴合的抗體或抗體混合物來進(jìn)行，和所述補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟采用通過正交熒光類型(FL2)的細(xì)胞熒光的測量手段。
18.根據(jù)權(quán)利要求
3-17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞標(biāo)記步驟通過至少一種選自下列的抗體來進(jìn)行CD3、CD4、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD34、CD45、CD63、CD64、CD71、CD203、CRTH2、FMC7和HLA-DR。
19.根據(jù)權(quán)利要求
3-17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)記步驟利用至少一種為分子探針的細(xì)胞標(biāo)記物，其選自至少一種染色劑、至少一種與染色劑或熒光染料綴合的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求
1-19中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述初步細(xì)胞學(xué)分析步驟和所述補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟同時(shí)測量同一流中的相同細(xì)胞組分的不同物理特征。
21.用于施行根據(jù)權(quán)利要求
1-20中任一項(xiàng)的方法的裝置，其特征在于，它包括以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行運(yùn)作的設(shè)備(1)，具有第一種測量手段(14、15、16、19)，包括至少一種能夠測量選自光學(xué)參數(shù)和電學(xué)參數(shù)的參數(shù)的測量通道，所述光學(xué)參數(shù)選自衍射、漫射、透射和熒光，以及所述電學(xué)參數(shù)包括阻抗；第二種分析手段(17)，包括至少一種能夠測量選自衍射、透射、熒光和吸光度的光學(xué)參數(shù)的測量通道；以及用于處理從第一種測量手段和第二種測量手段獲得的結(jié)果的計(jì)算機(jī)(20)。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21的裝置，其特征在于，所述第一種測量手段包括軸向衍射(FSC)的傳感器(14)、正交漫射(SSC)的傳感器(15)、正交熒光(FL1)的傳感器(16)和用于測量電阻率(RES)的電極(19)，以及所述第二種測量手段包括用于測量正交熒光(FL2)的傳感器(17)。
23.根據(jù)權(quán)利要求
21和22中任一項(xiàng)的裝置，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)(20)被布置用于將來自第一種測量手段和第二種測量手段的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，并形成來自第一種測量手段和第二種測量手段的結(jié)果的圖形。
24.根據(jù)權(quán)利要求
23的裝置，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)(20)被布置用于根據(jù)其家族或其物理特征對(duì)所述細(xì)胞組分進(jìn)行解釋和分類。
專利摘要
本發(fā)明涉及區(qū)分并計(jì)數(shù)在生物學(xué)流體樣品中存在的細(xì)胞組分的方法，包括一般通過流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備(1)施行的初步細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得一組初步結(jié)果，使得能夠?qū)悠分械乃屑?xì)胞組分區(qū)分成不同的群體并計(jì)數(shù)；以及基于所鑒定的細(xì)胞特性，對(duì)特定類型細(xì)胞組分進(jìn)行補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)分析步驟，以獲得補(bǔ)充結(jié)果，使得能夠區(qū)分并計(jì)數(shù)樣品的至少一種細(xì)胞群或亞群從而鑒定所述細(xì)胞特性。本發(fā)明特別適合于血液分析。
文檔編號(hào)G01N15/10GK1993610SQ20058002580
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年7月6日
發(fā)明者D·勒費(fèi)爾 申請(qǐng)人:奧里巴Abx股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan