專利名稱:超聲對比劑劑量配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一般的診斷顯像劑領(lǐng)域，特別涉及一種能夠提供增強的圖像和持續(xù)時間長的圖像的超聲對比劑(ultrasound contrast agent)劑量配方。
背景技術(shù)：
當(dāng)利用超聲來獲得人或動物內(nèi)部器官和結(jié)構(gòu)的圖像時，當(dāng)超聲波、聲能波以一定的頻率(當(dāng)超過該頻率時，能被人耳所感知)穿過人體時會被反射。不同類型的身體組織對超聲波的反射不同，由反射不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的超聲波所產(chǎn)生的反射可以被檢出并通過電子學(xué)方法轉(zhuǎn)換為可視圖像。
對于一些醫(yī)療情況，獲得人們感興趣的器官或結(jié)構(gòu)的有用的圖像尤其困難，這是因為在由缺乏對比增強劑的超聲波的反射而產(chǎn)生的超聲波圖像中，上述結(jié)構(gòu)的細節(jié)不能充分地從周圍的組織中被分辯出來。通過向感興趣的器官或其他結(jié)構(gòu)中給予超聲對比劑來提高超聲波圖像中的對比度，從而本質(zhì)上改善對某些生理和病理狀況的檢測和觀察。在有些情況下，對超聲對比劑自身運動的檢測是非常重要的。例如，由特定的心血管異常引起的獨特的血流模式只有通過對血流給予超聲對比劑并觀察血流或血容量才可以被識別。
當(dāng)超聲波穿過身體并被反射以產(chǎn)生能夠據(jù)此作出內(nèi)科診斷的圖像時，用作超聲對比劑的材料通過影響超聲波而發(fā)揮作用。
不同類型的物質(zhì)以不同的方式和不同的程度影響超聲波。此外，由對比增強劑所引起某些效果比其它試劑更容易被測量和觀察。在選擇理想的超聲對比劑組合物時，人們通常更喜歡那些當(dāng)超聲波穿過身體時對超聲波具有最顯著作用的物質(zhì)。此外，對超聲波的作用應(yīng)該易于測量。氣體是用作超聲對比劑的較好的介質(zhì)。氣體在使用之前必須固定化，其可以作為表面活性劑固定化氣泡或者通過用膠囊包在脂質(zhì)體或者微粒中。在超聲波圖像中可以看到三種主要的對比增強效果，即，背反射、射束衰減、和聲速差分。
已有多種天然的和合成的聚合物被用于包封例如空氣等超聲對比劑，這些聚合物有助于制造給藥后持續(xù)時間較長的超聲對比劑。Schneider等在Invest.Radiol.，Vol 27、pp.134-139(1992)中描述了三種微米級的、填充空氣的、合成的、聚合物顆粒。據(jù)報道這些顆粒在血漿中以及使用壓力下穩(wěn)定。然而，在2.5MHz時它們的回聲反射性低。另一種微泡混懸物已從超聲處理后的蛋白胚乳中被獲得。Feinstein等，J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.11，pp.59-65(1988)。Feinstein描述了具有良好的體外穩(wěn)定性、大小適合于肺與肺內(nèi)腔之間通道(transpulmonary passage)的微泡的制備。然而，由于這些微泡在壓力下不穩(wěn)定，它們在體內(nèi)壽命短暫，半衰期大約為幾秒鐘(與一個循環(huán)過程近似相等)。Gottlieb，S.等，J.Am.Soc.Echo.，Vol.3，pp.328(1990)，摘要；和Shapiro，J.R.等，J.Am.Coll.Cardiol.Vol.16，pp.1603-1607(1990)。
Rasor Associates公司也在WO 80/02365中對明膠包封的微泡進行了描述。所述明膠包封的微泡是通過“聚結(jié)”明膠而形成的。分子生物系統(tǒng)公司(Molecular Biosystems，Inc.)在WO96/04018中對包封在含氟材料的殼體內(nèi)部的氣體微泡進行了描述。
Fritzch等報道了用半乳糖微晶(SHU454和SHU508)固定化的微泡。Fritzsch，T.等，Invest.Radiol.Vol.23(Suppl 1)，pp.302-305(1988)；和Fritzsch T.等，Invest.Radiol.，Vol.25(Suppl1)160-161(1990)。該微泡在體外持續(xù)15分鐘但在體內(nèi)持續(xù)不到20秒。Rovai，D.等，J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.10，pp.125-134(1987)；和Smith，M.等，J.Am.Coll.Cardiol.，Vol.13，pp.1622-1628(1989)。Schering Aktiengesellschaft在歐洲專利EP 398 935中公開了用于超聲波顯像的微膠囊密封氣體或揮發(fā)性液體的制備以及用途，其中，微膠囊由合成聚合物或多糖形成。Sintetica在歐洲專利458745中公開了一種用于治療或診斷目的的空氣或氣體微球，該微球被能夠分散在含水載體中的界面沉積聚合物薄膜所包縛，用于注射到宿主動物體內(nèi)或用于口腔、直腸或尿道給藥。
Delta生物工程有限公司在WO 92/18164號專利中描述了一種用于成像的微粒的制備方法，該方法通過對蛋白質(zhì)水溶液進行噴霧干燥形成具有內(nèi)含氣體的空心球體。WO 93/25242號專利描述了用于超聲波成像的微粒的合成方法，所述微粒的結(jié)構(gòu)為在聚氰基丙烯酸酯或聚酯的外殼內(nèi)部含有氣體。WO 92/21382公開了一種微粒對比劑的制造，所述微粒對比劑包括含有氣體的共價鍵結(jié)合的基質(zhì)，其中，所述基質(zhì)為碳水化合物。Unger在美國專利第5,334,381號和5,123,414號以及5,352,435號中描述了用作超聲對比劑的脂質(zhì)體，其包括氣體、氣體前體例如pH活化或光活化氣體前體，以及其他的液體或固體對比增強劑。
其他人鑒于被包封的氣體的效果，也提出了與空氣相比增強顯像的氟化氣體的應(yīng)用。Quay在美國專利No.5,393,524中公開了包括全氟化碳在內(nèi)的多種試劑在超聲波顯像中增強反襯度的應(yīng)用。上述試劑由經(jīng)挑選的氣體小氣泡或微泡組成，其在溶液中顯示出較長的壽命，并且足夠小以至于能夠穿過肺，這使得其能夠在心血管系統(tǒng)及其他重要器官的超聲波圖像中得以應(yīng)用。Bracco在歐洲專利554213公開了氟化烴氣體對預(yù)防微泡在曝露于血流壓力時的崩解的作用。Nycomed在WO95/23615專利中公開了一種用于顯像的微膠囊，該微膠囊由包含全氟化碳的溶液例如蛋白質(zhì)溶液等凝結(jié)而形成。麻省理工學(xué)院(Massachusetts Institute ofTechnology)在專利WO95/03357中公開了一種由聚乙二醇-聚(丙交酯-共-乙交酯)塊狀聚合物形成的微粒，該微粒內(nèi)包封有顯像劑，包含氣體例如空氣和全氟化碳。如同Sonus藥物公司在WO94/16739中所描述的，當(dāng)固體和液體反射聲波達到一個相似的程度，眾所周知，氣體是用作超聲對比劑的更有效且更受歡迎的介質(zhì)。事實上，如WO 94/16739的實施例12所示，當(dāng)對小型豬給藥時，蛋白質(zhì)微膠囊由于產(chǎn)生安全問題(以及功效問題)而不予考慮。美國專利6,132,699和5,611,344都描述了在合成聚合物外殼中使用全氟化碳來增強對比度的方法。美國專利5,837,221描述一種生產(chǎn)多孔聚合物微粒的方法，該方法將疏水性試劑合并入聚合物中來增加回聲反射性。
有數(shù)種超聲對比劑在美國和歐洲都獲批準(zhǔn)，用于很有限的強心劑用藥。OPTISON(Amersham，Mallinkrodt)包含含有八氟丙烷氣體的熱變性人白蛋白微膠囊。每毫升微球體混懸物包含5-8×108個平均直徑為2-4.5微米粒度范圍和220μg的八氟丙烷。這些微球體還沒有被批準(zhǔn)用于心肌血流評估，僅僅被批準(zhǔn)用于心室增強作用。在較高的丸劑劑量下(5mL混懸物或1100μg八氟丙烷)，心室增強作用持續(xù)達5分鐘。
DEFINITY(Bristol Myers醫(yī)學(xué)成像)包含含有脂類微球體的八氟丙烷，其中脂類殼由磷脂DPPA、DPPC、和mPEG-DPPE組成。每毫升混懸物包含1.2×1010個微粒，該微粒的平均直徑在1.1-3.3微米的粒度范圍內(nèi)且具有1100μg八氟丙烷。該試劑僅僅被批準(zhǔn)用于心室增強作用，而沒有被批準(zhǔn)用于心肌血流評估。在700μL的丸劑劑量(用于70kg的人)下或5133μg的氣體下，試劑在心室內(nèi)增強作用的持續(xù)時間大約為3.4分鐘。
IMAGENT(Photogen公司)包含含有全氟己烷的脂類微球體，其中，脂類外殼由磷脂DMPC組成。每毫升混懸物包含1.4×109個微粒和92μg的全氟己烷，其中，該微粒具有小于3微米的平均直徑。該試劑僅僅被批準(zhǔn)用于心室增強作用，而沒有被批準(zhǔn)用于心肌血流評估。在0.43毫升的丸劑劑量(用于70kg的人)下或40μg的氣體下，試劑在心室內(nèi)的增強作用的平均持續(xù)時間大約為2.6分鐘。
在任何情況下，這些商品試劑僅具有有限的應(yīng)用，沒有被批準(zhǔn)用于除心室增強作用之外的其他應(yīng)用，這些試劑在心室的平均顯像增強持續(xù)時間為5分鐘或更少。仍然缺少能夠增強心血管系統(tǒng)特別是心肌和心室的顯像且具有較長持續(xù)時間的商業(yè)超聲對比劑?，F(xiàn)有技術(shù)中描述的試劑，當(dāng)作為丸劑或短浸劑給藥時，產(chǎn)生的心肌圖像的持續(xù)時間明顯小于處理一個完整的心臟測試所需要的時間。一般地，現(xiàn)有技術(shù)的藥劑所提供的圖像其用于心肌時的持續(xù)時間不到一分鐘。人們希望獲得這樣的試劑，它能夠提供的增強顯像持續(xù)時間在心肌中為超過一分鐘和/或在心室中為大于5分鐘。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種尤其適用于強心劑的劑量配方，其包含微粒，其中，微粒能夠提供增強的圖像和持續(xù)時間長的圖像。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種試劑盒，用于在超聲波顯像方法中包含微粒的劑量配方給藥。

發(fā)明內(nèi)容人們已經(jīng)開發(fā)了具體的劑量配方并已經(jīng)將其用于臨床研究，該劑量配方使用了聚合物微粒，將能夠提供顯著且持續(xù)時間長的增強顯像的全氟化碳氣體合并入其中。該劑量配方典型地包括一、二或直到五個劑量，最好為一個或兩個劑量的微粒，所述微粒由最好含有脂類的生物相容的聚合物形成，其含有在體溫時為氣體的全氟化碳。所述微粒以對增強超聲波顯像有效的劑量給患者投藥，在心室內(nèi)的持續(xù)時間為大于五分鐘和/或在心肌中為大于一分鐘，劑量范圍從0.025到8.0mg微粒/kg體重。優(yōu)選給患者給藥的劑量范圍為從0.05到4.0mg微粒/kg體重。在一個優(yōu)選方案中，在心室中超聲波顯像的增強作用持續(xù)大于9分鐘，和/或在心肌中則為大于2分鐘。
劑量配方典型地用小瓶或注射器提供。在一個典型的配方中，劑量配方呈干粉形式，使用之前需用無菌水重新配制，具體而言向裝有干粉的小瓶或注射器內(nèi)添加水，然后搖動以產(chǎn)生等滲或等壓的微粒懸浮液。在這些劑量配方的優(yōu)選方案中，懸浮液包含1.0-3.5×109微粒/mL，或25-50mg微粒/mL，最優(yōu)選的濃度是懸浮液包含1.5-2.8×109微粒/mL或30-45mg微粒/mL。在一個優(yōu)選方案中，微粒的平均粒度小于8微米、最好是平均粒度為1.8-3.0微米。
在最佳方案中，氣體是CF4、C2F4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F8、C4F10、或SF6。在優(yōu)選方案中，氣體是全氟正丁烷(n-perfluorobutane)(C4F10)，以75-500μg/mL的微?；鞈椅锏慕o藥量提供；優(yōu)選全氟正丁烷以100-400μg/mL的微粒混懸物的給藥量提供；最好是全氟正丁烷以150-350μg/mL的微粒混懸物的給藥量提供；或者氣體是八氟正丙烷，以75-375μg/mL的微?；鞈椅锏慕o藥量提供，最好為以120-300μg/mL的微?；鞈椅锏慕o藥量提供。
在最佳方案中，微粒由合成聚合物形成，所述合成聚合物例如有聚醇酸，包括聚乳酸、聚羥基乙酸、和聚(乳酸-共-羥基乙酸)，聚乙交酯(polyglycolides)、聚交酯和聚(丙交酯共乙交酯)，聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴(polyalkylenes)，例如聚乙烯和聚丙烯，聚烷撐二醇，例如聚乙二醇，聚氧化烯烴例如聚環(huán)氧乙烷，聚乙烯醇、聚戊酸、和聚(丙交酯共己內(nèi)酯)、衍生物、共聚物及其混合物，以及相對于聚合物重量以0.01-30wt％的比例含有一個疏水化合物的聚合物，最好為以0.01-30wt％(脂類重量/聚合物重量)的比例含有脂類的聚合物。在一個特別優(yōu)選方案中，脂類為二油酰基磷脂酰膽堿(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(dimyristoylphosphatidylcholin，DMPC)、雙十五?；字Ｄ憠A(dipentadecanoylphosphatidylcholine，DPDPC)、二月桂?；字Ｄ憠A(dilauroylphosphatidylcholine，DLPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二花生?；字Ｄ憠A(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰膽堿(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、雙二十三烷酰基磷脂酰膽堿(ditricosanoylphosphatidylcholine DTPC)、二木脂?；字Ｄ憠A(dilignoceroylphatidylcholine DLGPC)；或磷脂酰乙醇胺。
最好是，微粒中的合成聚合物是聚(丙交酯共乙交酯)，丙交酯對乙交酯的比例為50∶50(即1∶1)，重均分子量在20,000-40,000道爾頓的范圍內(nèi)，微粒中的疏水化合物是DAPC，比例為5∶6.6％(DAPC重量/聚合物重量)。
劑量配方可以以包含微粒干粉的小瓶或注射器形式提供，或者以包含重懸浮微粒溶液的試劑盒形式提供。典型地，干粉的小瓶或注射器中也包含賦形劑例如糖或食鹽，使得溶液等滲，或者重新配制后等滲。然后，將此劑量配方作為丸劑或注射劑通過注射給患者給藥，在整個30分鐘的期間內(nèi)進行顯像。
微粒在多種診斷顯像程序中都很有用，包括超聲波顯像、磁共振成像、熒光檢查、X射線和計算機化層析檢查。在用于心臟病學(xué)應(yīng)用例如心肌血流評估和心室增強作用的臨床試驗中對微粒進行了檢驗。
具體實施方式這里，對改進后的方法、微粒、試劑盒、和用于超聲波顯像的劑量配方進行描述。微粒在各種診斷超聲波顯像的應(yīng)用中非常有用，特別在超聲程序中例如血管顯像和超聲波心動描記法例如心肌血流評估、心肌血容量評估和心室增強作用中非常有用。
I.定義除非另作說明，和通常所使用的一樣，術(shù)語″微?！灏ā逦⑶蝮w″和″微膠囊″，以及其他的微粒。微粒在形狀上可以是球形的或非球形的。
這里″微膠囊″一般被定義為具有一個包圍著氣體核心的外部聚合物殼的微粒?！拔⑶蝮w”被定義為可以是固體球形，或者由遍及充滿氣體的聚合物的氣孔所形成的蜂窩狀構(gòu)造或海綿樣結(jié)構(gòu)的多孔球形。一些微球體可以包含由遍及聚合物外殼的充滿氣體的氣孔所形成的具有蜂窩狀構(gòu)造或海綿樣結(jié)構(gòu)的外部聚合物外殼。對于這類微球體，該外部聚合物外殼包圍內(nèi)部的氣體核心。
和通常所使用的一樣，術(shù)語″劑量(dosage)″和″藥量(dose)″是同義詞，表示一次給予的物質(zhì)量，或產(chǎn)生預(yù)期診斷或?qū)Ρ刃Ч璧奈镔|(zhì)量。
這里所使用的術(shù)語″劑量配方″，是指小瓶或其他容器例如注射器，其包含一個或多個劑量的要求產(chǎn)生預(yù)期診斷或?qū)Ρ刃Ч奈镔|(zhì)。
與常規(guī)一樣，這里″患者的部位″是指患者身上的一個特定的區(qū)域或部分。在有些情況下，″患者的部位″是指遍及患者全身的部位。這種部位的例子有肺部、胃腸部、心血管部位(包括心肌組織或心肌(例如心臟肌肉)、心室的室、圍鰓腔、瓣膜功能)、腎部位以及身體的其他部位、組織、器官等等、包括脈管組織和循環(huán)系統(tǒng)、以及有病的組織、包括癌組織。″患者的部位″例如包括將要被診斷圖像顯像的部位。盡管患者的部位″也″可能是體外的，但是最好在體內(nèi)。
與習(xí)慣一樣，這里″脈管組織″表示血管(包括動脈、靜脈、毛細血管等)。
與習(xí)慣一樣，這里″胃腸部位″包括食管、胃、小腸和大腸以及直腸所定義的部位。
與習(xí)慣一樣，這里″腎部位″是指腎和直接連接腎的脈管組織，包括腹主動脈。
與習(xí)慣一樣，這里″目標(biāo)部位″和″目標(biāo)區(qū)″交叉使用，均表示希望藥劑到達的患者部位。
與習(xí)慣一樣，這里″欲顯像部位″和″顯像部位″交叉使用，均表示患者的預(yù)期顯像部位。
與習(xí)慣一樣，這里″心室血流或心室增強作用″是指血流以一個或多個心臟循環(huán)穿過心臟的心室。
與習(xí)慣一樣，這里″心房血流″是指血流以一個或多個循環(huán)穿過心臟的心房。
與習(xí)慣一樣，這里″心肌血流″是指血液以一個或多個循環(huán)數(shù)在心臟肌肉或心肌的脈管組織中(包括在心臟的血管中)的流動。
與習(xí)慣一樣，這里″心肌血容量″是指在心臟肌肉或心肌的脈管組織中的血液的量。
與習(xí)慣一樣，這里″心動周期″是指心臟的一個完整的收縮周期，包括心臟的舒張周期和收縮周期。
與習(xí)慣一樣，這里″增加的亮度″是指與沒有超聲對比劑而獲得的圖像相比，圖像在亮度上的增加。
與習(xí)慣一樣，這里″增強的顯像″是指與沒有超聲對比劑而獲得圖像相比，亮度相對增加了的圖像。
與習(xí)慣一樣，這里″持續(xù)時間″是指顯像的增加亮度可以被檢出的總時間。
與習(xí)慣一樣，這里″冠狀動脈血管擴張劑″是指生理活性物質(zhì)例如雙嘧哌胺醇(dipyridamole)或腺苷，當(dāng)這些藥物被患者服用時，能夠引起心血管部位脈管組織的擴張。
II.微粒在優(yōu)選方案中，微粒包含聚合物、脂類和全氟化碳氣體。微?？梢约劝⑶蝮w也包含微膠囊，或只包含微球體或微膠囊。
聚合物在優(yōu)選方案中，微粒由合成聚合物形成。合成聚合物產(chǎn)生生物相容且無生物材料污染的微粒。
另外，優(yōu)選合成聚合物，是因為合成聚合物在體外和體內(nèi)可再生合成和降解。根據(jù)體內(nèi)穩(wěn)定性所需要的時間選擇聚合物，該例如時間是分布到欲顯像的部位所需要的時間，以及顯像所需要的時間。合成聚合物可以被修飾以產(chǎn)生性質(zhì)不同的微粒(例如，改變分子量和/或功能基團)。
典型的合成聚合物有聚醇酸例如聚乳酸、聚羥基乙酸、和聚(乳酸共羥基乙酸)、聚乙交酯(polyglycolides)、聚交酯、聚(丙交酯共乙交酯)及其混合物、聚酐、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴，例如聚乙烯和聚丙烯、聚二醇例如聚乙二醇、氧化聚烯烴例如聚環(huán)氧乙烷聚乙烯醇、聚戊酸、和聚(丙交酯共己內(nèi)酯)、及其衍生物、共聚物和混合物。這里“衍生物”包括化學(xué)基團經(jīng)取代、加成的聚合物，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的烷基、烷撐、羥基化、氧化及其他修飾。
優(yōu)選的可生物降解的聚合物的具體例子包括醇酸例如乳酸和羥基乙酸的聚合物、聚交酯、聚乙交酯(polyorthoesters)、聚(丙交酯共乙交酯)、與PEG的共聚物、聚酐、聚(鄰)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯共己內(nèi)酯)及其共聚物。最佳優(yōu)選聚合物是聚(丙交酯共乙交酯)，其中丙交酯對乙交酯的比例為50∶50(即1∶1)且聚合物的重均分子量在20,000-40,000道爾頓范圍內(nèi)。重均分子量(Mw)是基于單個聚合物鏈分布內(nèi)具有給定分子量的分子質(zhì)量而計算出的平均分子量。Mw可以用凝膠滲透色譜法(GPC)來測定。
疏水化合物在一個優(yōu)選方案中，如美國專利No.5,837,221所描述的，聚合物包括一種疏水化合物。通常，例如脂類，它是疏水性的且在聚合物內(nèi)部的量是一個有效劑量，結(jié)合這樣的化合物會通過微粒限制水的滲透和/或吸收，也因此限制了微粒中氣體的損失。
這會有效增加由包含脂類、合成聚合物和包封有氣體尤其是氟化氣體例如全氟化碳的微粒所提供的增強顯像的持續(xù)時間。
能夠用來固定聚合物微粒內(nèi)部氣體的脂類包括但不局限于下列種類的脂類脂肪酸及其衍生物、甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂、鞘脂類、膽固醇和類固醇衍生物、萜烯和維生素。
脂肪酸及其衍生物可以包括(但不局限于)飽和和不飽和脂肪酸、奇數(shù)和偶數(shù)的脂肪酸、順反異構(gòu)體、以及脂肪酸衍生物包括乙醇、酯、酸酐、羥基脂肪酸和前列腺素?？梢允褂玫娘柡秃筒伙柡椭舅岚ǖ痪窒抻诰哂?2-22個碳原子的直鏈或支鏈分子?？梢允褂玫娘柡椭舅岬睦影ǖ遣痪窒抻谠鹿鹚?、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸?？梢允褂玫牟伙柡椭舅岬睦影ǖ遣痪窒抻谠鹿鹚?、抹香鯨酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、巖芹酸和油酸?？梢允褂玫闹ф溨舅岬睦影ǖ遣痪窒抻诋愒鹿鹚?、異肉豆蔻酸、異棕櫚酸、異硬脂酸和異戊二烯類。脂肪酸衍生物包括12-(((7′-二乙氨基香豆素-3-)羰基)甲氨基)-硬脂酸；N-[12-(((7′二乙氨基香豆素-3-)羰基)甲基氨基)十八?；鵠-2-氨基棕櫚酸、N-丁二酰-二油酰磷脂酰基乙醇胺和棕櫚酰-高半胱氨酸；和/或它們的組合物?？梢允褂玫母视蛦熙ァ⒏视投?、甘油三酯及其衍生物包括但是不局限于分子的碳原子數(shù)為6-24之間的脂肪酸或脂肪酸的混合物，二半乳糖基二甘油酯、1，2-二油?；?sn-甘油；1，2-二棕櫚酰基-sn-3-丁二?；视?；和1，3-二棕櫚?；?2-丁二?；视?。
能夠使用的磷脂包括但是不局限于磷脂酸、帶有飽和與不飽和脂類的卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心磷脂、和β-?；榛字Ａ字睦影ǖ遣痪窒抻诙王；字Ｄ憠A(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、雙十五?；字Ｄ憠A(dipentadecanoylphosphatidylcholine，DPDPC)、二月桂酰基磷脂酰膽堿(dilauroylphosphatidylcholine，DLPC)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二花生?；字Ｄ憠A(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔?；字Ｄ憠A(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、雙二十三烷?；字Ｄ憠A(ditricosanoylphosphatidylcholine DTPC)、二木脂?；字Ｄ憠A(dilignoceroylphatidylcholine DLPC)；和磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂?；掖及?dioleoylphosphatidylethanolamine)或1-十六烷基-2-棕櫚酰甘油磷酸乙醇胺。也可以使用帶有不對稱的酰基鏈(例如帶有一個6碳原子的?；満土硪粋€12碳原子的?；?的合成磷脂。
可以使用的鞘脂類包括神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦苷脂類、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦硫脂和溶血腦硫脂。神經(jīng)鞘脂的例子包括但是不局限于神經(jīng)節(jié)苷脂GM和GM2。
可以使用的類固醇包括但是不局限于膽固醇、膽固醇硫酸酯、膽固醇半琥珀酸酯、6-(5-膽固醇-3β-氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-α-D-乳糖吡喃糖苷、6-(5-膽甾烯-3β-氧)己基6-氨基6-脫氧-1-硫代-α-D-甘露吡喃糖苷以及(膽甾烯基-4′-三甲基-35-胺基)丁酸酯。
可以使用的其他的脂類化合物包括生育酚及其衍生物，以及油和衍生油，例如硬脂酰胺。
許多陽離子脂類都可以使用，例如DOTMA，N-[1-(2，3-二氧化油?；?丙基-N，N，N-三甲基氯化物；DOTAP、1，2-二氧化油酰基-3-(三甲氨基)丙烷；和DOTB、1，2-二油?；?3-(4′-三甲基)丁?；?sn-甘油。
最優(yōu)選的脂類是磷脂，最好為DPPC、DAPC、DSPC、DTPC、DBPC、DLPC，最好為DPPC、DSPC、DAPC和DBPC。
脂類的含量范圍為0.01-30％(脂類重量/聚合物重量)；最好為0.1-20％(脂類重量/聚合物重量)，最優(yōu)選為1-12％(脂類重量/聚合物重量)。
當(dāng)微粒由本發(fā)明所述的方法形成時，其大小可以得到良好的重現(xiàn)。這里，除非另作說明，術(shù)語顆粒的″大小″或″直徑″是指數(shù)均粒子大小。下面列舉一個可用于定義數(shù)均粒子大小(Xn)的等式的例子。
Xn=Σi=1∞nidiΣi=1∞ni]]>這里，ni＝一個給定直徑(di)的粉粒數(shù)目這里，術(shù)語″體積平均直徑″是指體積重量直徑平均。下面列舉一個可用于定義體積平均直徑(Xv)的等式的例子
Xv=[Σi=1∞nidi3Σi=1∞ni]1/3]]>這里，ni＝一個給定直徑(di)的顆粒數(shù)目。
粒度分析可以使用庫爾特懸浮物測定儀，通過光學(xué)顯微術(shù)、掃描電子顯微術(shù)、透光度電鏡檢術(shù)、激光衍射法例如使用Malvern Mastersizer、光散射法或傳播時間間隔法而進行。這里″庫爾特方法″是指將粉末分散在電解液中，然后用配備有一個50μm口徑的管子的CoulterMultisizer II對得到的懸浮液進行分析。該方法能夠提供大小測量和顆粒濃度。
在用于制備能穿過肺毛細血管床的可注射微粒的優(yōu)選方案中，微粒直徑小于8微米。大的微?？赡茏枞未?，小的微?？赡懿荒芴峁┏浞值膶Ρ刃Ч?。用于靜脈給藥的超聲對比劑，其微粒的大小優(yōu)選在0.75～5微米之間，最好為1.8～3.0微米之間。
在優(yōu)選方案中，微粒具有蜂窩狀構(gòu)造或海綿樣結(jié)構(gòu)，由遍及聚合物的氣孔形成，或者微粒具有帶有蜂房或海綿樣多孔結(jié)構(gòu)的聚合物外殼。在這兩種情況下，氣孔都是充滿氣體。這些微粒是通過包含造孔劑例如如下所述碳酸銨的聚合物溶液噴霧干燥而形成的。
超聲對比劑氟化氣體的例子包括CF4、C2F4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F8、C4F10和SF6。優(yōu)選全氟正丁烷(C4F10)，因為它能提供在使用溫度下不會凝聚的不可溶氣體，并且是藥學(xué)上可接受的。
含有微粒的氣體的量取決于氣體的種類，但一般給藥量是75-500μg/mL微粒懸浮液。對于全氟正丁烷，優(yōu)選的氣體含量是給藥量為100-400μg/mL微粒懸浮液，最好是給藥量為150-350μg/mL微粒懸浮液。對于八氟正丙烷，優(yōu)選的氣體含量是給藥量為75-375μg/mL微粒懸浮液，最好是給藥量為120-300μg/mL微粒懸浮液。
III制造微粒的方法微?？梢酝ㄟ^許多方法制造，優(yōu)選用噴霧干燥制造。主要的標(biāo)準(zhǔn)是，在形成微粒前，聚合物必須溶解或熔化于疏水化合物或脂類。
溶劑在形成期間，聚合物通常溶于溶劑中。這里，聚合物溶劑是指揮發(fā)性有機溶劑或具有相對低的沸點或可以在真空下除去，并且在對人進行痕量給藥時是可以可接受的，例如二氯甲烷。也可以使用其他的溶劑，例如乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、四氫呋喃(THF)、甲酰胺、乙酸、二甲基亞砜(DMSO)和氯仿，或其混合物。通常，聚合物溶于溶劑以形成濃度為0.1～60％(重量對體積(w/v))的聚合物溶液，更好的是在0.25～30％(w/v)之間，最好為0.5-10％(w/v)之間。
噴霧干燥微粒最好用噴霧干燥來生產(chǎn)，將生物相容的聚合物和脂類溶解在一個適當(dāng)?shù)娜軇┲校瑢⒃炜讋┳鳛楣腆w或溶液分散到聚合物溶液中，然后將聚合物溶液和造孔劑噴霧干燥，形成微粒。這里，聚合物溶液和造孔劑的″噴霧干燥″的過程是指對聚合物溶液和造孔劑進行霧化以使其形成薄霧，以及與熱載氣直接接觸從而使其干燥的過程。利用本領(lǐng)域常用的噴霧干燥器，聚合物溶液和造孔劑在噴霧干燥器的進氣口被霧化，通過至少一個干燥室，然后以粉末狀被收集。溫度根據(jù)所使用的氣體或聚合物不同而可以改變。可以通過控制入口和出口的溫度來產(chǎn)生所希望的產(chǎn)品。
在噴霧干燥過程中所形成的微粒的尺寸和形態(tài)受以下因素影響用于對聚合物溶液和造孔劑進行噴霧的噴嘴功能、噴嘴的壓力、帶有造孔劑的聚合物溶液的流速、所使用的聚合物、溶液中聚合物的濃度、聚合物溶劑的種類、造孔劑的類型和量、噴霧溫度(入口和出口溫度)和聚合物的分子量。通常，假定聚合物溶液濃度一樣，那么聚合物分子量越高，顆粒尺寸越大。
噴霧干燥的一般工藝參數(shù)如下入口溫度＝30-200℃、出口溫度＝5-100℃、聚合物流速＝10-5,000ml/min。
可以在噴霧干燥前使聚合物溶液和造孔劑與氣體一起乳化，從而使氣態(tài)診斷劑包封。或者，可以在噴霧干燥步驟產(chǎn)生充氣微粒，接著通過對微粒施加全氟化碳氣體，將空氣替換為所希望的氣體，或者對微粒抽真空來除去包封的空氣，然后充滿所希望的全氟化碳氣體。如果采用抽真空步驟來交換氣體，可以使用冷凍干燥器或真空箱。
促進微?；纬傻奶砑觿┰谖⒘５男纬蛇^程中，可以添加各種表面活性劑。可以使用的乳化劑或表面活性劑(0.1-15％w/w聚合物)的例子包括生物學(xué)上最可接受的乳化劑。其例子包括天然和合成的與氨基酸相結(jié)合的膽汁鹽或膽汁酸，以及非結(jié)合的去氧牛黃膽酸和膽酸。
相對于聚合物溶液的體積，造孔劑以0.01％～90wt％的量包含在聚合物溶液中，以增加孔的形成。例如，在噴霧干燥中，可以以固體形式或者溶解于溶劑例如水中的溶液形式使用造孔劑，所述造孔劑可以列舉揮發(fā)性鹽例如重碳酸銨、乙酸銨、碳酸銨、氯化銨或苯甲酸銨或其他的揮發(fā)性鹽。然后，將固體造孔劑或包含造孔劑的溶液與聚合物溶液一起乳化，以產(chǎn)生造孔劑在聚合物中的分散體或微滴。然后將這些分散體或乳劑噴霧干燥來除去聚合物溶劑和造孔劑。聚合物沉淀后，可以將硬化的微粒冷凍和凍干以除去所有在聚合物沉淀步驟中沒有被除去的造孔劑。
優(yōu)選利用聚合物形成微粒，例如丙交酯對乙交酯的比例為50∶50且重均分子量在20,000-40,000道爾頓范圍內(nèi)的聚(丙交酯共乙交酯)，以及磷脂，5-6.6％(DAPC重量/聚合物重量)的二花生酰磷脂酰膽堿(diarachidoylphosphatidylcholine)((1，2-二花生?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(DAPC))((1，2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。微粒在甘露醇和吐溫80中進一步配制加工以產(chǎn)生在冷凍干燥器上用全氟正丁烷再充氣的微粒干粉。干粉在使用前用5ml無菌水重新配制，向干粉的小瓶中添加水然后振搖以產(chǎn)生在等滲的甘露醇中的微粒懸浮液。優(yōu)選懸浮液的性質(zhì)為每一個給藥量微粒懸浮液含有氣體含量為150-350μg/ml的全氟正丁烷，微粒懸浮液的給藥量為1.5-2.8×109個微粒/毫升，微粒懸浮液的給藥量為30-45mg微粒/毫升，平均粒度在1.8-3.0微米的范圍內(nèi)。
IV微粒的應(yīng)用1.給患者給藥的配方微?？梢杂觅x形劑進一步加工以產(chǎn)生干粉。在給患者給藥前用藥學(xué)可接受的載體進行重新配制時，賦形劑提供張力或滲透性或減輕微粒的懸浮性。適合于提供滲透性或張力的賦形劑有糖和鹽，糖包括而不限于甘露醇、右旋糖(dextrose)或葡萄糖，鹽包括而不限于氯化鈉或磷酸鈉。適合于提供減輕微球體懸浮性的賦形劑包括任何藥學(xué)可接受的潤濕劑或表面活性劑，包括而不限于聚山梨醇酯80(吐溫80)、聚山梨酸酯20(吐溫20)、普盧蘭尼克(Pluronic)或聚乙二醇。作為參考，這里描述一些適合于提供滲透性或張力或能被用作潤濕劑的賦形劑，例如《藥物賦形劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》(第四版，大不列顛皇家藥物協(xié)會，科學(xué)與實踐出版社)或《雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實踐》(第十九版，Mack出版公司)。微粒和賦形劑的干粉通過在賦形劑的溶液中懸浮微粒而產(chǎn)生。如果需要的話，可以進一步使用尺寸分級分離步驟。賦形劑溶液中的微粒被裝入小瓶或注射器中，冷凍、凍干、產(chǎn)生干粉配方。在凍干步驟結(jié)束時，通過用全氟化碳氣體回充冷凍干燥器使微粒充滿全氟化碳氣體。然后將小瓶或注射器用塞子塞住或蓋上蓋子，是小瓶的情況下，將塞子邊緣卷曲翻下。這導(dǎo)致在小瓶或注射器的頂部空間充滿全氟化碳。
或者，可以用藥物賦形劑與微粒干法混合，然后裝入小瓶或注射器。將小瓶注射器放在冷凍干燥器上或真空箱中抽真空，然后讓微粒充滿全氟化碳氣體。然后將小瓶或注射器用塞子塞住或蓋上蓋子，是小瓶的情況下，將塞子邊緣卷曲翻下。這導(dǎo)致在小瓶或注射器的頂部空間充滿全氟化碳。
2.劑量單位可以使用不同尺寸劑量單位的微粒。例如一個小劑量單位可以包含25-75mg的微粒。一個中劑量單位可以包含75-150mg。一個大的劑量單位可以包含150-250mg的微粒。一個特大的劑量單位可以包含150-1000mg的微粒。
當(dāng)在重新配制后形成微粒懸浮液時，懸浮液中微球體的質(zhì)量濃度一般在20～60mg/mL范圍內(nèi)變動。懸浮液中微球體的質(zhì)量濃度優(yōu)選25-50mg/mL，懸浮液中微球體的質(zhì)量濃度最優(yōu)選為30-45mg/mL。懸浮液中微粒的濃度優(yōu)選1.0-3.5×109微粒/mL，懸浮液中微粒的濃度最優(yōu)選為1.5-2.8×109微粒/毫升。優(yōu)選微粒具有小于8微米的平均粒度，最好在1.8-3.0微米的范圍內(nèi)。
藥學(xué)可接受的載體包括注射用水、無菌水、鹽水、含有甘油的鹽水、含有吐溫20的鹽水、含有吐溫80的鹽水、等滲的葡萄糖(5％)、1/2等滲的右旋糖(2.5％)、等滲的甘露醇(5％)、1/2等滲的甘露醇(2.5％)、含有吐溫20的等滲甘露醇、含有吐溫80的等滲甘露醇。
3.試劑盒能夠提供用于包含全氟化碳氣體的微粒腸胃外給藥的試劑盒。該試劑盒包含至少兩個組分。一個成分包含小瓶或注射器中的一個劑量單位的干粉對比劑，另一個成分包含小瓶或注射器中的藥學(xué)可接受的載體。在對患者給藥之前，藥學(xué)可接受的載體被添加至干粉對比劑的劑量單位內(nèi)，形成充有氣體的微粒懸浮液，所述微粒懸浮液在任何給藥途徑的診斷顯像中可用作超聲波顯像對比劑。
4.用于微粒的小瓶或容器對于試劑盒，不需要特殊的小瓶或注射器或接管，普通的小瓶、注射器和接管即可用于微粒。對小瓶的唯一要求就是在塞子和容器之間有良好的密封。因此，封口的質(zhì)量就成為主要關(guān)心的問題，任何封口完整性的下降都將導(dǎo)致不希望的物質(zhì)進入小瓶或氣體外泄。除了保證無菌之外，對于在減壓下塞住的產(chǎn)品而言為保證安全正確的重新配制，真空度的保持是必不可少的。關(guān)于塞子，可以是以彈性體為基礎(chǔ)的單個化合物或多組分的配方，例如聚(異丁烯)或“丁基橡膠”，而且必須不能讓所使用的氣體透過。根據(jù)小瓶內(nèi)干粉的總劑量選擇小瓶的尺寸。小瓶的尺寸優(yōu)選5mL、10mL、20mL和30mL。根據(jù)注射器內(nèi)干粉的總劑量選擇注射器的尺寸。注射器的尺寸優(yōu)選5mL、10mL、20mL和50mL。
5.診斷應(yīng)用微粒組合物可用于許多不同的診斷應(yīng)用中，包括超聲波顯像、磁共振成像、熒光檢查、X射線和計算機化層析檢查。
在優(yōu)選方案中，微粒被用于超聲程序，例如血管顯像和超聲波心動描記法，包括而不限于心室顯像、心肌血流評估、心肌血容量評估、冠狀動脈疾病的診斷和射血分數(shù)評估。
微?？捎糜谘茱@像、用于檢測肝和腎疾病，用于檢測和表征腫瘤塊和組織、和測量外周血液速度。微粒也可以和配位體連結(jié)在一起，所述配位體將組織的粘附力最小化或者使顆粒靶向體內(nèi)的具體部位。
獲得圖像的一般方法干粉微粒在使用前用藥學(xué)可接受的載體重新配制，然后采用適當(dāng)?shù)耐緩饺缱⑸淙胙?例如靜脈內(nèi)(i.v)或動脈內(nèi)(i.a))或口服，對患者給藥一個有效的量，用于檢測。微粒組合物可以以推注或短輸液(小于30分鐘)的方式對患者靜脈內(nèi)給藥。優(yōu)選注射控制在15秒至20分鐘的時間內(nèi)，最好為30秒至15分鐘。一般地，對于患者，通常每次靜脈注射控制在從0.025到8mg/kg體重的劑量范圍內(nèi)，最好為0.05到4mg/kg的劑量范圍。
對于診斷超聲應(yīng)用，至少對患者身體的一部分施加能量以使目標(biāo)組織顯像。然后獲得患者體內(nèi)部位的可見圖像，由此可以確定存在或不存在有病的組織。包括二次諧波成像和門控成像(gated imaging)在內(nèi)的超聲成像技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)都已為大家所熟知，并且也有一些描述，例如Uhlendorf，IEEE Transactions on Ultrasonics，F(xiàn)erroelectrics，and Frequency Control，14(1)70-79(1994)；和Sutherland等，Journal of the American Society of Echocardiography，7(5)441-458(1994)，在此，將其全部并入本文引為參考。
可以用傳感器來施加超聲波。如果希望的話，超聲可以是脈沖的或者可以是連續(xù)的。因此，診斷超聲通常包括回波的應(yīng)用，隨后，在一個監(jiān)聽周期內(nèi)，超聲傳感器接收反射信號?？梢允褂弥C波、高諧波或次諧波?？梢杂行褂媒邮?x頻率的第二諧波方式，這里x是非主要的頻率。這可以用來減少來自背景物質(zhì)的信號，利用顯像劑增強來自傳感器的信號該顯像劑靶向希望的位置，例如血塊。其他的諧波信號，例如奇數(shù)諧波信號、例如3x或5x，也可以同樣地用這種方法接收。次諧波信號例如x/2和x/3，也可以同時被接收并處理以形成圖像。
另外，可以施加功率多普勒(Power Doppler)或彩色多普勒(Color Doppler)。在功率多普勒的情況下，功率多普勒的相對較高的能量可以讓氣孔共振。這可以產(chǎn)生在次諧波或高次諧波等范圍內(nèi)的聲波輻射，與施加的超聲頻率相同。
具體的顯像應(yīng)用這里所描述的微粒可被用于心臟病學(xué)和放射學(xué)用途。對于心臟病學(xué)的應(yīng)用，對患者給藥微粒組合物，用超聲儀掃描患者來獲得心血管部位的可視圖像。作為選擇，微粒組合物可以與藥物學(xué)的應(yīng)激物或物理的應(yīng)激物聯(lián)合給藥。適宜的藥物學(xué)應(yīng)激物包括雙嘧哌胺醇或腺苷等冠狀動脈的血管擴張劑，多巴酚丁胺等影響收縮力的藥劑(例如增強心臟收縮力)，或多巴酚丁胺等心肌變速劑(例如增強收縮頻率)。適宜的物理應(yīng)激物包括體育鍛煉，例如使用踏車或固定自行車。
對于放射學(xué)的應(yīng)用，對患者給藥微粒組合物，用超聲儀掃描患者來獲得患者的欲檢查部位的可視圖像。
微?？捎糜谠u定心血管系統(tǒng)的功能以及評定心肌血流或心肌血容量或診斷冠心病(冠狀動脈病)。例如，微?？梢栽鰪娦氖绎@像，因此可以通過血管壁運動分析幫助進行局部的心臟功能分析，通過射血分數(shù)測量有助于綜合心臟功能分析。該微粒還可以用來評價心肌血流以將功能性心臟組織與局部缺血(血流不足)心臟組織或梗塞(死的)心臟組織區(qū)別開來。在心肌中檢測到的對比度信號可以用作心肌血容量的估算，因為超聲對比劑經(jīng)靜脈給藥后駐留在血管內(nèi)。一段時間內(nèi)，在一個特定的心肌部位反襯強度或圖像亮度的缺失或減少是血流減少(也就是不足)的表征。
一般的，除非患者有嚴(yán)重的冠心病，如同例如用超聲對比的方法所評價的一樣，心臟各個部位的血流量應(yīng)該表現(xiàn)為正常。為了檢測沒有嚴(yán)重心臟病的病人的血流異常，或檢測較小的心肌血流不足，必須通過誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)來增加血流對心臟的需求?？梢酝ㄟ^讓患者鍛煉或給藥藥物化合物例如血管擴張劑、影響收縮力的藥劑或心肌變速劑來誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。在鍛煉或藥物應(yīng)激反應(yīng)期間，可以更容易地檢測到血流不足，這是因為，在由帶有狹窄癥的冠狀動脈供血的部位，增加血流的能力降低了。在超聲對比劑給藥后的心肌超聲波圖像對照可以在預(yù)應(yīng)激狀態(tài)之前(即安靜狀態(tài))和應(yīng)激狀態(tài)下制成。在應(yīng)激反應(yīng)顯像期間發(fā)現(xiàn)不需增強亮度的心肌部位而在安靜顯像期間卻沒有發(fā)現(xiàn)上述部位，這就是缺血的征兆。在應(yīng)激反應(yīng)顯像期間和安靜顯像期間都發(fā)現(xiàn)不需增強亮度的心肌部位，則是梗塞的征兆。
在一個實施方式中，心肌血流可以通過以下步驟來測定(1)對患者進行首次注射，給藥微粒組合物，(2)用超聲儀掃描患者進行成像以獲得心血管部位的可視圖像，(3)用藥物應(yīng)激物或鍛煉誘發(fā)患者應(yīng)激狀態(tài)，(4)第二次注射給藥微粒組合物并繼續(xù)掃描，以及(5)通過用肉眼直接觀察或者用定量圖像分析對在步驟(2)和(4)中得到的圖像差異進行評價。
對于放射學(xué)應(yīng)用，微?？梢杂脕砀倪M用于放射學(xué)指征的超聲波顯像的能力，包括腎、肝和末梢血管疾病的顯像，增加血流和血流模式的可視度，并且改進對身體內(nèi)部深處的細微病變或結(jié)構(gòu)的檢測。微粒能被用于大血管(macrovascular)和微細血管(microvascular)的指示。在大血管的指示中(身體主動脈和靜脈的疾病狀態(tài)和條件的診斷)，通過目測顱內(nèi)血管，微粒可以有助于檢測中風(fēng)和預(yù)中風(fēng)的情況，通過評價頸動脈狹窄的程度、血管接枝不閉合和末梢血管血栓形成，微?？梢杂兄跈z測在大的血管內(nèi)(例如頸動脈)的動脈粥樣硬化。對于微細血管指征(疾病狀態(tài)和通過分析微細血管血流模式的診斷)，微?？梢杂兄谧R別肝臟內(nèi)的病變、腫瘤或其他的疾病(例如腺瘤或血管瘤)，和腎、脾內(nèi)的病變、腫瘤或其他的疾病(例如脾動脈的動脈瘤)，以及胸部、卵巢、其他的組織和器官的病變、腫瘤或其他的疾病。
可以通過給患者給藥微粒組合物然后用超聲波掃描患者進行顯像，以獲得患者身上任何病變組織的可視圖像，從而對患者的病變組織進行診斷。病變組織可以表現(xiàn)為某個亮度增強的部位或者沒有顯示出亮度增強的部位。
用微粒組合物獲得的增強圖像微粒在給藥后產(chǎn)生增強圖像。增強圖像可以通過與沒有服用超聲對比劑時相比圖像亮度的增大、或者通過圖像中人工圖像的基本消除得以表現(xiàn)。因此，與心血管部位包括心臟組織和相連的脈管組織的超聲波顯像相關(guān)聯(lián)，增強圖像可以通過例如心血管部位圖像亮度的增加和/或心血管部位圖像中出現(xiàn)的人工圖像的基本消除而得以表現(xiàn)。單個藥劑給藥后圖像持續(xù)10秒至60分鐘。圖像優(yōu)選持續(xù)20秒至30分鐘，最好持續(xù)30秒至20分鐘。在一個優(yōu)選方案中，在心室中超聲波顯像增強持續(xù)大于5分鐘，和/或在心肌中則為大于1分鐘。
可以通過肉眼裸視觀察或使用定量顯像分析來對圖像亮度的增大進行評價。用特定的灰度(大約從0到大約255VDUs或色標(biāo))作為參考作如上鑒別，優(yōu)選亮度增大水平至少有大約10VDUs(灰度)。更優(yōu)選亮度增大水平大于大約10VDUs，例如大約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100VDUs。在一些實施方式中，亮度增加大于大約100VDUs，例如，大約105、110、115、120、125、130、135、140、145、或150VDUs。在其他的實施方式中，亮度增加大于大約150VDUs，例如，大約155、160、165、170、175、180、185、190、195、或200VDUs?；蛘撸炼仍龃蟠笥诖蠹s200VDUs、例如，大約205、210、215、220、225、230、235、240、245、250或255VDUs。
通過結(jié)合下述非限制性的實施例可以進一步理解上述方法和組合物。
實施例材料醋酸、重碳酸銨、甘露醇USP、和聚山梨醇酯80(沒有源自動物的成分)購自SpectrumChemicals公司(Gardena、CA)。聚合物(聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)(50∶50))和二花生酰磷脂酰膽堿(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(DAPC))分別購自勃林格殷格翰公司(Ingelheim，德國)和Avanti公司(Alabaster，AL)。二氯甲烷購自EM Science公司(EMDChemicals，Gibbstown，NJ)。小瓶(30毫升管狀小瓶)和塞子(20毫米、灰色、單排氣口，F(xiàn)luro-Tec公司)來自West Pharmaceutical Services公司(Lionville，PA)。全氟正丁烷(DFB)氣體購自F2化學(xué)品有限公司(Lancashire，英國)。
分析方法微粒質(zhì)量濃度的定量分析小瓶內(nèi)微粒的質(zhì)量濃度采用ICP-MS法(感偶等離子質(zhì)譜法)進行定量。微粒中聚合物的數(shù)量通過用ICP-MS法對錫進行分析而測定。存在于微粒中的聚合物的數(shù)量，是根據(jù)存在于微粒中的錫的數(shù)量與存在于用來制造微粒的特定份額的聚合物中錫的數(shù)量相比較而測定的。微粒中磷脂的數(shù)量通過用ICP-MS對磷進行分析而測定。存在于微粒中的磷的數(shù)量是根據(jù)存在于微粒中的磷的數(shù)量與存在于磷脂本身的磷的數(shù)量進行比較而測定的。每毫升懸浮液中微粒的質(zhì)量是這樣計算的將每小瓶中聚合物和磷脂的數(shù)量加起來，然后除以重新配制的體積(5mL)。
粒度分析將重新配制的微粒樣品添加到電解質(zhì)溶液中，用裝有50μm口管的Coulter Multisizer II對得到的懸浮液的顆粒大小和微粒濃度進行分析。
微粒的氣體含量將干粉小瓶用5mL水重新配制，振搖產(chǎn)生微粒懸浮液。用針和注射器穿過塞子取出一組0.3毫升等分試樣，對得到的懸浮液中的DFB含量進行分析。將這些等分試樣注入密封口的頂空小瓶。頂空小瓶在室溫下平衡至少10小時。然后將樣品加熱到45℃，在頂空采樣器恒溫箱中保持20分鐘。采用氣相色譜法，用吹氣包裹的進口和火焰離子檢測器對懸浮液上面的頂空氣體進行分析。采用面積單點校準(zhǔn)法進行定量。
氣相色譜法系統(tǒng)參數(shù)和溫度程序列于表1和表2。
表1GC系統(tǒng)參數(shù)
表2GC溫度程序
實施例1用作超聲對比劑的微粒制造25℃下將176g的PLGA、10.6g的二花生酰磷脂酰膽堿(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DAPC))、和2.26g的醋酸溶解在5.88L二氯甲烷中，配制成有機溶液。將由68.5g的重碳酸銨溶于338ml注射用水中形成的水溶液添加至上述有機溶液中，用轉(zhuǎn)子定子乳化混合器在10L勻漿槽中以4310RPM的轉(zhuǎn)速勻漿10分鐘。
用氮氣作為霧化氣體和干燥氣體對產(chǎn)生的乳化液進行噴霧干燥。乳劑在工作臺頂端被噴霧干燥，噴霧干燥器采用購自Spraying Systems公司(Wheaton，IL)的空氣噴霧噴嘴和購自Buchi公司(Brinkmann，Westbury，NY)的玻璃干燥室/旋風(fēng)分離裝置。噴霧干燥條件如下乳劑流速為40ml/min，霧化氣體流速為30L/min，干燥氣體流速為46kg/hr，出口溫度為12℃。
通過分散、冷凍、和凍干步驟對噴霧干燥后的產(chǎn)品進一步加工。在5.0L水中溶解140g甘露醇和4.10g聚山梨醇酯80，配制含水介質(zhì)。將噴霧干燥后的微粒以25mg/ml的濃度分散在上述介質(zhì)中。用購自Misonix公司(Farmingdale、紐約)的不銹鋼、800級、流動池超聲波儀對分散體進行解凝聚并使其過篩直徑10″的振動篩子(RBF-10)(購自Vorti-Siv公司(Salem，OH))。超聲波儀用4℃的夾套保護，防止分散體發(fā)熱。分散體以150mL/min的速度依次過篩25μm和20μm的篩子。將過篩后的分散體裝入小瓶(10ml分散體裝入30ml的小瓶)，局部塞上塞子，浸入液氮中冷凍。
冷凍后，將小瓶凍干。凍干完成后，隔離容器，將全氟正丁烷(DFB)再充氣到小瓶中，以使加塞前的壓力達到5千帕。
干粉在使用前用5ml無菌水重新配制，向干粉的小瓶中添加水然后振搖，以得到微粒懸于等滲的甘露醇中的懸浮液。懸浮液包含2.2×109微粒/mL，37mg微粒/mL，微粒的平均粒度為2.2微米。
實施例2微粒的氣體泄漏速率用氣相色譜法(GC)對根據(jù)實施例1的方法生產(chǎn)的兩批微粒(批1和批2)各自的氣體泄漏速率進行評價，詳見上述分析方法一節(jié)。第三批微球體(批3)以類似實施例1的方法生產(chǎn)，只是在生產(chǎn)微粒過程中省去磷脂、二花生酰磷酸脂膽堿(1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(DAPC))。
表3微粒的氣體含量和氣體泄漏速率
包含DAPC的微粒在70分鐘后丟失了大約10％的起始氣體含量，而不含DAPC的微粒丟失了87％的起始氣體含量。另外，包含DAPC的微粒相對于沒有DAPC的微粒具有一個較高的初始氣體含量。這表明包含DAPC對于在噴霧干燥過程中微粒內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)的形成以及保持微粒內(nèi)部的氣體是很重要的。
對患者給藥后，希望使用的超聲對比劑總持續(xù)時間根據(jù)所應(yīng)用的心臟病學(xué)或放射學(xué)超聲檢驗的種類不同而不同，通常大約是30秒到60分鐘。因此，如果超過超聲檢驗的周期，那么對包含脂類DAPC的微粒氣體損失的測定就沒有意義了。
實施例3作為微粒劑量功能的心臟圖像增強在健康成年人身上對根據(jù)實施例1所述方法生產(chǎn)的微粒進行研究。干粉在使用前重新配制，向小瓶中添加5mL無菌水并振搖小瓶10次。在產(chǎn)生的懸浮液中的微球體的最終濃度大約是37mg/mL。受試者接收0.5mg/kg、2.0mg/kg或者4.0mg/kg體重的單個劑量。受試者用連續(xù)諧波顯像(幀頻15Hz，傳感器頻率2.1/4.2MHz)進行經(jīng)胸廓的超聲波成像。對圖像進行增強作用強度和持續(xù)時間的視覺評價。
在2mg/kg和4mg/kg的劑量下，心室增強作用持續(xù)時間都超過9分鐘。在這兩個劑量下，當(dāng)受試者在30分鐘后被再次成像時，15人中有13人仍然可見到對比效果，這表明微粒提供了長時間的增強作用。
心室增強作用的持續(xù)時間概括于表4。
表4左心室圖像增強的持續(xù)時間
實施例4微粒和商品在評價心臟圖像中的比較對兩個體重和心臟功能相匹配的成年人進行心臟超聲波顯像的比較研究。對第一個受試者給予實施例1的方法所生產(chǎn)的微粒單一制劑。干粉在使用前重新配制，即向小瓶中添加5ml無菌水然后振搖小瓶10次。所產(chǎn)生的懸浮液中微球體的最終濃度大約是37mg/mL，懸浮液的氣體含量大約是250g/mL。第一個受試者接受4mg微粒/kg的劑量，這個劑量相當(dāng)于27g/kg體重的氣體劑量。第二個受試者接受單一劑量的市售超聲對比劑OPTISON(AmershamHealth)，其含有包含蛋白胚乳微球體的全氟丙烷。兩個受試者接受的是相同總量的氣體(27μg/kg體重)，所述氣體是聲波活性組分。兩個受試者用連續(xù)諧波顯像(幀頻15Hz，傳感器頻率2.1/4.2MHz)進行經(jīng)胸廓的超聲波成像。對圖像進行增強作用強度和持續(xù)時間的視覺評價。
心室增強作用和心肌增強作用的持續(xù)時間概括于表5。
表5不同超聲對比劑圖像增強的持續(xù)時間
用實施例1所述的方法生產(chǎn)的微粒在心室和心肌中均能提供增強的圖像，所述增強的圖像的持續(xù)時間顯著長于OPTISON，對于用超聲實施一個完整的心臟測試具有適當(dāng)?shù)某掷m(xù)時間。
實施例5用微粒配方對心肌血流進行評估來評價局部缺血對一個被診斷為冠心病的受試者給藥用實施例1的方法生產(chǎn)的微粒。受試者在60分鐘內(nèi)接受了兩次微粒注射。首次微粒注射(“安靜注射”，1.7mg/kg)用來評價安靜狀態(tài)下的心肌。進行第二次微粒注射前，用血管擴張劑雙嘧哌胺醇(0.56mg/kg)使受試者產(chǎn)生藥理學(xué)的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)后，受試者接受第二次微粒注射(“應(yīng)激反應(yīng)注射”，1.3mg/kg)，來評價處于應(yīng)激狀態(tài)下的心肌。
對受試者給藥微粒后的安靜和應(yīng)激狀態(tài)圖像進行比較，顯示出圖像增強的增加最小的心肌部位，并且這個部位在應(yīng)激誘導(dǎo)后面積變大。這表明心肌組織的區(qū)域既有梗塞也有缺血性部分。局部缺血的檢測用另一個診斷技術(shù)-核顯像得以證實。給藥99Tc(MIBI)后進行安靜和應(yīng)激反應(yīng)的核灌注(nulear perfusion)，用市售的γ粒子計數(shù)管對受試者成像。在安靜和應(yīng)激反應(yīng)的超聲圖像上記錄下來的損傷在安靜和應(yīng)激反應(yīng)的核灌注圖像中得以確認。
權(quán)利要求
1.一種提供增強超聲對比圖像的劑量配方，其包含微粒，所述微粒含有生物相容聚合物并包封有在體溫下為氣體的全氟化碳，其特征在于，當(dāng)微粒通過靜脈給藥時，所述劑量配方包含足以在心室中提供大于五分鐘的增強超聲波圖像或者在心肌中提供大于一分鐘的增強超聲波圖像的微粒劑量。
2.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，所述劑量配方提供的增強超聲波圖像在心室中持續(xù)大于9分鐘，或在心肌中持續(xù)大于2分鐘。
3.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，所述劑量配方提供的增強超聲波圖像在心室中持續(xù)至少30分鐘。
4.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，包含0.025～8.0mg微粒/kg體重的劑量。
5.如權(quán)利要求
4所述的劑量配方，其特征在于，包含0.05～4.0mg微粒/kg體重的劑量。
6.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，其為微粒干粉，使用之前可以用無菌水重新配制，通過向裝有干粉的小瓶或注射器內(nèi)添加水，搖動以產(chǎn)生微粒的等滲懸浮液。
7.如權(quán)利要求
6所述的劑量配方，其特征在于，所述劑量配方形成微粒濃度范圍為1.0×109到3.5×109微粒/mL的懸浮液或微粒質(zhì)量濃度為25～50mg微粒/mL的懸浮液。
8.如權(quán)利要求
7所述的劑量配方，其特征在于，所述劑量配方形成微粒濃度范圍為1.5×109到2.8×109微粒/mL的懸浮液或微粒質(zhì)量濃度為30～45mg微粒/mL的懸浮液。
9.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，所述微粒具有小于8微米的平均粒度。
10.如權(quán)利要求
9所述的劑量配方，其特征在于，所述微粒具有1.9～2.6微米的平均粒度。
11.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，包含0.5～4.0mg微粒/kg體重的劑量。
12.如權(quán)利要求
11所述的劑量配方，其特征在于，所述劑量從0.5mg微粒/kg體重、2.0mg微粒/kg體重和4.0mg微粒/kg體重中選擇。
13.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，所述氣體選自CF4、C2F4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F8、C4F10和SF6。
14.如權(quán)利要求
13所述的劑量配方，其特征在于，所述氣體是全氟正丁烷(C4F10)，以75～500μg/mL給藥量的微粒懸浮液提供。
15.如權(quán)利要求
14所述的劑量配方，其特征在于，所述氣體是全氟正丁烷(C4F10)，以100～400μg/mL給藥量的微粒懸浮液提供。
16.如權(quán)利要求
15所述的劑量配方，其特征在于，所述氣體是全氟正丁烷(C4F10)，以150～350μg/mL給藥量的微粒懸浮液提供。
17.如權(quán)利要求
15所述的劑量配方，其特征在于，所述氣體是八氟正丙烷(C3F8)，以75～375μg/mL給藥量的微粒懸浮液提供。
18.如權(quán)利要求
17所述的劑量配方，其特征在于，所述八氟正丙烷(C3F8)以120～300g/mL給藥量的微粒懸浮液提供。
19.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，所述微粒由選自聚醇酸、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷撐、聚烷撐二醇、聚氧化烷撐、聚戊酸、聚(丙交酯共己內(nèi)酯)及其共聚物和混合物中的合成聚合物形成。
20.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，進一步包含疏水化合物，所述疏水化合物與聚合物以0.01～30％(疏水化合物重量/聚合物重量)的比例混合。
21.如權(quán)利要求
20所述的劑量配方，其特征在于，所述疏水化合物為脂類，所述脂類與聚合物以0.01～30％(脂類重量/聚合物重量)的比例混合。
22.如權(quán)利要求
21所述的劑量配方，其特征在于，所述脂類是磷脂，選自二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)、雙十五?；字Ｄ憠A(DPDPC)、二月桂酰基磷脂酰膽堿(DLPC)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、二花生?；字Ｄ憠A(DAPC)、二山萮炔?；字Ｄ憠A(DBPC)、雙二十三烷?；字Ｄ憠A(DTPC)、二木脂酰基磷脂酰膽堿(DLGPC)和磷脂酰乙醇胺。
23.如權(quán)利要求
22所述的劑量配方，其特征在于，所述聚合物是丙交酯與乙交酯的比例為1∶1、重均分子量為20～40kDa的聚(丙交酯共乙交酯)，所述脂類是以5～6.6％(脂類重量/聚合物重量)的比例與所述聚合物混合的二花生酰磷脂酰膽堿。
24.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，是在小瓶或注射器中含有微粒干粉。
25.如權(quán)利要求
24所述的劑量配方，其特征在于，所述小瓶或注射器進一步含有一種或多種選自糖、鹽和表面活性劑的賦形劑。
26.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，是在試劑盒中，所述試劑盒含有裝有干燥微粒的小瓶或注射器和裝有用來使微粒再懸浮的溶液的小瓶或注射器。
27.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，主要包含一個或兩個劑量。
28.如權(quán)利要求
1所述的劑量配方，其特征在于，主要包含多至五個劑量。
29.一種提供增強的超聲波圖像的方法，其特征在于，包括給患者施以根據(jù)權(quán)利要求
1～28中任一項所述的劑量配方，然后對患者身上某一個區(qū)域進行成像，以產(chǎn)生與沒有對比劑存在時相比有所增強的圖像。
30.如權(quán)利要求
29所述的方法，其特征在于，進一步包括對患者施以藥劑，以對患者的心血管系統(tǒng)施壓，對患者再次成像。
31.如權(quán)利要求
29所述的方法，其特征在于，要成像的區(qū)域選自心血管部位、肝、腎、脾、胸部和卵巢。
32.一種試劑盒，包含如權(quán)利要求
1～28中任一項所述的劑量配方，和用于重新配制所述劑量配方的溶液。
33.一種制造用于超聲對比顯像的劑量配方的方法，包括在溶液中懸浮含有生物相容聚合物和疏水化合物的微粒，其中所述溶液可選擇性含有賦形劑；將所述懸浮液放入小瓶或注射器中；冷凍所述懸浮液；使所述小瓶凍干以在小瓶或注射器中產(chǎn)生干粉；和用全氟化碳氣體回充冷凍干燥器以得到如權(quán)利要求
1～28中任一項所定義的劑量配方。
34.一種制造用于超聲對比顯像的劑量配方的方法，包括將含有生物相容聚合物的微粒和疏水化合物干法混合，所述化合物可選擇性含有賦形劑；將混合物放入小瓶或注射器中；對所述小瓶抽真空，用全氟化碳氣體充滿小瓶或注射器以得到如權(quán)利要求
1～28中任一項所定義的劑量配方。
專利摘要
臨床研究已經(jīng)實施并開發(fā)了具體的劑量配方，該劑量配方使用了能夠提供顯著增強顯像且持續(xù)時間長的全氟化碳氣體，將其并入聚合物的微粒開發(fā)而成。劑量配方包括由生物相容聚合物和全氟化碳形成的微粒，其中，聚合物最好混有脂類，全氟化碳在體溫下為氣體。所述微粒以對增強超聲波顯像有效的劑量給患者給藥，在心室的時間為大于5分鐘和/或在心肌中為大于一分鐘，劑量范圍為0.025到8.0mg微粒/kg體重。劑量范圍優(yōu)選為0.05到4.0mg微粒/kg體重。所述劑量配方一般是裝在小瓶內(nèi)提供。在一個典型的配方中，劑量配方由使用之前需用無菌水重新配制的干粉形成，具體而言向裝有干粉的小瓶或注射器內(nèi)添加水，然后搖動以產(chǎn)生等滲的或等滲壓的微粒懸浮液。
文檔編號A61K49/22GK1993147SQ20048004371
公開日2007年7月4日 申請日期2004年6月4日
發(fā)明者理查德·沃勒維奇, 霍華德·伯恩斯坦, 唐納德·E·柴克林Ⅲ, 茱麗·斯常博 申請人:阿庫斯菲爾公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan