專利名稱:枯草芽孢桿菌nb12及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)(微生物農(nóng)藥)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌NB12及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病原菌(包括真菌、細(xì)菌、病毒等)引起的植物病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。立枯絲核菌solani Kiihn)是一種經(jīng)濟(jì)上非常重要的植物病原真菌。在我國(guó)，由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病已居水稻三大病害之首。該病菌除了可引起水稻、玉米等紋枯病外，還可引起其它很多植物(蔬菜、果樹(shù)、林木、花卉等)的苗期立枯病。目前對(duì)該病的防治主要是使用化學(xué)農(nóng)藥(殺菌劑)，而殺菌劑多是單作用位點(diǎn)的內(nèi)吸性藥劑，長(zhǎng)期使用會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，并且會(huì)污染環(huán)境，而殘留的殺菌劑會(huì)影響到食品安全。
植物周圍不僅存在病原菌，而且還存在著大量的非病原菌，其中有的還是病原菌的拮抗微生物。這些拮抗微生物可通過(guò)與病原菌的抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等機(jī)理來(lái)抑制病原菌，達(dá)到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物對(duì)環(huán)境安全，不像化學(xué)農(nóng)藥那樣造成環(huán)境污染以及對(duì)人畜的毒害，同時(shí)拮抗微生物不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，有些還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，且實(shí)際生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單。因此，利用拮抗微生物來(lái)防治植物病害的研究正越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的重視。目前，人們已經(jīng)分離到多種對(duì)各種不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己經(jīng)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段，產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)效益和環(huán)境效益。
人們對(duì)枯草芽孢桿菌spp.)的研究較多，該菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和短桿菌肽等，對(duì)病原菌具有明顯的抑制作用，自身還可以合成α -淀粉酶、脂肪酶和 纖維素酶等，可用于動(dòng)物飼料添加劑，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用；同時(shí)該菌種還可以刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育。
關(guān)于枯草芽孢桿菌)在防治水稻紋枯病和其它病害方面也有報(bào)道，如中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00410014484.1 (公開(kāi)號(hào)CN1590535)公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌JA，對(duì)水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌等多種植物病原菌都具有抑制作用；中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00910212779.2 (公開(kāi)號(hào)CN101697737A)公開(kāi)了將枯草芽孢桿菌和三環(huán)唑復(fù)配后作為殺菌劑用于防治水稻稻瘟病，防治效果最高達(dá)84.67%;中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01010175797.0 (公開(kāi)號(hào)CN101857848A)公開(kāi)了一種水稻紋枯病生防菌枯草芽孢桿菌WJ-1及菌劑與應(yīng)用，該菌劑對(duì)水稻紋枯病室內(nèi)活體接種防治效果明顯，最高可達(dá)95.74% ;此外，相關(guān)的文獻(xiàn)還有:陳志誼等.枯草芽孢桿菌Β-916防治水稻紋枯病的田間試驗(yàn).中國(guó)生物防治，1997 ;陳志誼等.水稻紋枯病拮抗細(xì)菌Β-916培養(yǎng)條件與發(fā)酵配方的研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999 ;陳衛(wèi)良等.拮抗細(xì)菌feci77心subtilis A30對(duì)水稻病原菌的抑制作用.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997 ;徐漢虹等.枯草桿菌BS04菌株抑真菌素的初步研究.農(nóng)藥，2007 ;張_霞等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，植物病理學(xué)報(bào),2005。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一株具有可抑制包括水稻紋枯病菌和豆角苗期立枯病菌在內(nèi)的多種植物病原菌的廣譜拮抗菌菌株。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
枯草芽孢桿菌NB12，該菌株的分類命名為枯草芽孢桿菌subtilis,于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.5383。該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本發(fā)明還提供了一種生物菌劑，該生物菌劑含有枯草芽孢桿菌NB12或含有枯草芽孢桿菌NB12發(fā)酵液(即培養(yǎng)液)經(jīng)過(guò)濾后的無(wú)菌濾液，所述無(wú)菌濾液優(yōu)選用枯草芽孢桿菌NB12培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)離心取得的上清再經(jīng)過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾獲得。
該枯草芽孢桿菌iB.subtilis) NB12的培養(yǎng)方法，發(fā)酵(培養(yǎng))條件如下:培養(yǎng)基為L(zhǎng)B (酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 18 g、水1000 mL)或BPY培養(yǎng)基(牛肉膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、蛋白胨IOg、NaCl 5g、瓊脂20g蒸懼水IOOOml，調(diào)pH至7.2)，在30°C、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)48h即可。優(yōu)選初始pH值為7.0,40 mL/250 mL (種子/培養(yǎng)基)裝液量。
枯草芽孢桿菌(漢NB12在制備防治植物病原菌引起的植物病害菌劑中的應(yīng)用。所述植物病原菌為立枯絲核菌iRhizoctonia solani)、香蕉炭疽病菌iColletotrichum musae、、稻痕病菌iPyricularia oryzae)> 小麥赤霉病菌iGibberella zeae)、香蕉枯萎病菌oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystis ai/i/705 )、番爺葉霉病菌{Fulvia ZWFa)、水稻白葉枯病菌CfefliAofflmas oryzae pv.0rjzae)和水稻細(xì)菌性條斑病菌(Z oryzae pv.0ryzicola)。
枯草芽孢桿菌(漢)NB12在防治立枯絲核菌0 .引起的植物病害中的應(yīng)用，尤其對(duì)水稻紋枯病和豆角苗期立枯病防治效果較好。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公布的枯草芽孢桿菌(漢subtilis) NB12菌株對(duì)水稻紋枯病的防效較高，特別是對(duì)于水稻紋枯病菌菌核的萌發(fā)有明顯的抑制作用，這在以往的文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。菌核是水稻紋枯病初侵染的重要來(lái)源，抑制菌核的萌發(fā)能有效地控制該病害的發(fā)生，這是本發(fā)明的特點(diǎn)之一。同時(shí)，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌iB.)NB12菌株對(duì)其它多種植物病原菌也有很好的抑制作用，與中國(guó)專利公開(kāi)的其它枯草芽孢桿菌菌株的防治對(duì)象不一樣，尤其是能夠用于蔬菜上防治苗期立枯病0 .具有廣泛的應(yīng)用前景和價(jià)值。這在以往的文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(B,subtilis) NB,12發(fā)酵液(菌劑)對(duì)水稻紋枯病和豆角苗期立枯病均表現(xiàn)出良好的防治效果，其中對(duì)離體水稻葉片紋枯病的防效達(dá)86.2%，對(duì)該病菌菌核萌發(fā)抑制率達(dá)84.52%，對(duì)盆栽水稻紋枯病的防效為57.51%，對(duì)豆角苗期立枯病的防效為65.38%。由此可見(jiàn)，該生防細(xì)菌NB12菌株在防治立枯絲核菌病害方面具有巨大的應(yīng)用前景。其菌劑的制備方法成熟，可開(kāi)發(fā)成微生物農(nóng)藥，是化學(xué)農(nóng)藥的替代品，可用于水稻紋枯病等立枯絲核菌病害和其它植物病害的防治，對(duì)減少化學(xué)農(nóng)藥殘留和污染、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義，是綠色農(nóng)業(yè)和有機(jī)農(nóng)業(yè)倡導(dǎo)的發(fā)展方向，符合我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，只需較簡(jiǎn)單的微生物發(fā)酵和制劑設(shè)備，就能進(jìn)行規(guī)模化推廣應(yīng)用，其市場(chǎng)前景是廣闊的，將帶來(lái)巨大的生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1.菌株NB12的序列與相近菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
圖2.枯草芽孢桿菌NB12對(duì)水稻紋枯病的防治效果，其中接種GD-118對(duì)照為不防治對(duì)照，CK為正常水稻對(duì)照。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1枯草芽孢桿菌NB12的篩選及鑒定
1、菌株的篩選
( I) 土壤樣品的采集
本實(shí)驗(yàn)從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)果園采集土樣，根據(jù)采集地的地形等采用5點(diǎn)法取樣，每個(gè)點(diǎn)取樣深度為耕作層或地表以下15 cm，取量200 250 g，每個(gè)地點(diǎn)采集的5個(gè)樣本均勻混合，裝入滅菌的封口聚乙烯袋，帶回實(shí)驗(yàn)室馬上分離。
(2)樣品懸浮液的制備
將土壤樣品加入滅菌水中激烈震蕩。樣品:水=1:9 (質(zhì)量與體積比)，如:10 g 土壤加入裝有90 mL滅菌水的三角瓶中 所得懸浮液濃度為ΚΓ1，每種樣品各準(zhǔn)備5支裝有9mL滅菌水的試管按10倍梯度稀釋法，將上述濃度為KT1的懸浮液稀釋成10_2 10_6的系列濃度懸浮液，即從I號(hào)試管中吸取I mL懸浮液放入2號(hào)試管(盛有9 mL滅菌水)中，充分震蕩混勻，再?gòu)?號(hào)試管中吸取I mL懸浮液放入3號(hào)試管(盛有9 mL滅菌水)中，依此類推，直至第6支試管為止。
(3)分離方法
采用LB培養(yǎng)基(酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 18 g、水1000 mL)。用移液器分別吸取上述不同稀釋度的溶液0.5mL，滴加于培養(yǎng)基平板上(每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù))，用滅菌的L型玻棒涂布均勻，稍晾干，作好標(biāo)記和日期，培養(yǎng)皿倒置，于25 28°C溫箱中培養(yǎng)2 3 d，把平板上長(zhǎng)出的單菌落挑出到新的培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對(duì)全部分離到的菌株(稱為待測(cè)菌株)進(jìn)行編號(hào)，然后對(duì)其拮抗活性進(jìn)行初篩和復(fù)篩，以獲得本專利菌株。
(4)拮抗菌的初篩和復(fù)篩
采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，檢測(cè)上述各種待測(cè)菌株對(duì)立枯絲核菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培養(yǎng)好的立枯絲核菌等病原菌的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，接種在PDA平板中央，再將已經(jīng)活化的各種待測(cè)菌株接種在立枯絲核菌等病原菌的菌絲塊四周2^3cm處，每個(gè)PDA平板接種4個(gè)待測(cè)菌株，設(shè)置不接種待測(cè)菌株的對(duì)照，每處理3次重復(fù)。在25 28°C下培養(yǎng)3 5 d，然后測(cè)量待測(cè)菌株與立枯絲核菌等病原菌之間的抑菌帶寬度，作為拮抗活性強(qiáng)弱的指標(biāo)。
經(jīng)過(guò)上述初篩和復(fù)篩，獲得一株對(duì)立枯絲核菌等多種病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株，編號(hào)為NB12，保存?zhèn)溆?。[0029]、NB12菌株的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生理生化鑒定
(I) NB12菌株的形態(tài)學(xué)鑒定
NB12菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后觀察，其單菌落圓形或不規(guī)則形，乳白色，表面粗糙有褶皺狀突起，不透明，無(wú)光澤，粘質(zhì)，不易乳化；在LB液體培養(yǎng)基中，輕度渾濁，色暗，表面形成完整白色粘質(zhì)膜。
(2) NB12菌株的分子生物學(xué)鑒定
經(jīng)克隆和測(cè)序，得到NB12菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1044bp，其序列如SEQ IDNO:1所示。
將NB12菌株的16S rDNA序列用Blast軟件與GenBank中已登陸的Bacillus subtilis (FJ595878.1) > Bacillus amyloliquefaciens (FJ641035.1)、Bacillus polyfermenticus (EF178464.1) > Bacillus pumilus (EF178456.1) > Bacilluslicheniformis (FJ713021.1)取 Bacillus velezensis (AB245422.1)的 16SrDNA 序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)和相似系數(shù)表(表I)。
表I菌株NB12和其它不同菌株間16S rDNA序列相似系數(shù)的比較
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5.)NB12,于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC N0.5383。
2.權(quán)利要求
1所述枯草芽孢桿菌NB12，其特征在于該菌株的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
3.—種生物菌劑，其特征在于含有權(quán)利要求
1或2所述枯草芽孢桿菌NB12或含有枯草芽孢桿菌NB12發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后的無(wú)菌濾液。
4.權(quán)利要求
1或2所述枯草芽孢桿菌NB12的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)條件如下:以LB培養(yǎng)基或者BPY培養(yǎng)基為培養(yǎng)基，在30°C、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)48h ； LB培養(yǎng)基配方:酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 18 g、水1000mL ； BPY培養(yǎng)基配方:牛肉膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、蛋白胨IOg、NaCl 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2。
5.權(quán)利要求
1或2所述枯草芽孢桿菌NB12在制備防治植物病原真菌或植物病原細(xì)菌引起的植物病害菌劑中的應(yīng)用； 所述植物病原真菌為立枯絲核菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄葉霉病菌； 所述植物病原細(xì)菌 為水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了枯草芽孢桿菌NB12及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，該菌株于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNo.5383。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)立枯絲核菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄葉霉病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌均具有強(qiáng)烈的抑制作用，為廣譜拮抗菌，可用于多種植物病害的防治，尤其是對(duì)水稻紋枯病和豆角苗期立枯病的防治效果較好，且具有對(duì)人畜無(wú)害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不容易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，能夠進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01P1/00GKCN102433282 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110423435
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年12月16日
發(fā)明者周而勛, 舒燦偉, 楊媚, 周登博, 張德濤, 曹琦琦 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan