本發(fā)明涉及一種納噴霧質(zhì)譜離子源，尤其涉及一種基于機型反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源及其操作方法。

背景技術(shù)：

在現(xiàn)有技術(shù)中，質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)是一種將不同化合物按質(zhì)荷比(m/z)進行分離和檢測的裝置。質(zhì)譜具有高靈敏度、多物質(zhì)同時檢測的能力以及化學(xué)專一性，因而在化合物的定性和定量分析中備受青睞。近年來，隨著生命科學(xué)，尤其是細胞生物學(xué)的興起，質(zhì)譜被廣泛地應(yīng)用于痕量生物分子的檢測。很多生物分子具有含量低、樣品難以制備，并且需要保存于緩沖鹽體系中的特點，這對質(zhì)譜的靈敏度及其對緩沖鹽基質(zhì)的耐受性提出了更高的要求。

離子源是質(zhì)譜不可或缺的組成部分，也是直接影響質(zhì)譜檢測靈敏度及基質(zhì)耐受性的關(guān)鍵部件之一。近年來提出的納噴霧離子源(nano-electrospray ionization，nano-ESI)是較為成功的一種生物樣品離子源。納噴霧離子源需要在特殊拉制的納噴霧噴針(nano-tip)上實現(xiàn)。nano-tip一般為中空的玻璃或石英管。經(jīng)拉制，管子的一端被加工成為具有1-10μm內(nèi)徑的尖端。測樣前，溶液樣品被注入nano-tip中。進樣量為5μL左右。檢測時，樣品溶液被施加1-2kV直流高壓電。在高壓電場的驅(qū)動下，樣品溶液從nano-tip尖端形成電噴霧，實現(xiàn)生物分子的離子化。

相對于普通電噴霧(electrospray ionization，ESI)而言，nano-ESI具有較低的流動相流速(nL/min級別)和較高的離子化效率，且對緩沖鹽基質(zhì)具有一定的耐受性，更有利于痕量生物分子的檢測。此外，nano-ESI不需要輔助氣的協(xié)助，裝置更為簡單。這些優(yōu)勢使得nano-ESI在生化領(lǐng)域受到更為廣泛的應(yīng)用。

在普通ESI或nano-ESI中，正離子模式的信號增強一般依賴于向溶液中添加額外的有機酸(如0.1％甲酸或乙酸等)。樣品中的高濃度緩沖鹽基質(zhì)需要進行額外的預(yù)處理降低其濃度或徹底除去，以防止對待測分子的信號產(chǎn)生干擾。

隨著應(yīng)用研究的不斷深入，人們需要進一步提高nano-ESI的檢測靈敏度及其對緩沖鹽基質(zhì)的耐受性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高檢測靈敏度以及對緩沖鹽基質(zhì)具有高耐受性的基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源以及其操作方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源，包括

納噴霧噴針，用于裝載樣品溶液；

金屬電極，插入到納噴霧噴針內(nèi)，與樣品溶液直接接觸；

絕緣端蓋，封堵在納噴霧噴針的尾端，防止漏電；

高壓電源，具有正反雙向輸出功能，與金屬電極連接，連接金屬電極的電線穿過絕緣端蓋。

優(yōu)選地，所述高壓電源的正向輸出電壓范圍為0至+3kV，反向輸出電壓范圍為0至-5kV。

優(yōu)選地，所述金屬電極為惰性電極。

優(yōu)選地，所述惰性電極為鉑絲。

一種基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源的操作方法，包括如下步驟：

S1，從納噴霧噴針的尾端注入樣品溶液；

S2，將金屬電極從納噴霧噴針尾端插入到納噴霧噴針內(nèi)，直至金屬電極與樣品溶液接觸到；

S3，用絕緣端蓋封住納噴霧噴針的尾端并連通高壓電源和金屬電極；

S4，打開高壓電源先對金屬電極輸出-2.5kV至5.0kV電壓，持續(xù)輸出3s至12s；然后對金屬電極輸出+1.5kV至+2.0kV電壓，用于產(chǎn)生納噴霧。

優(yōu)選地，在步驟S4中，在打開高壓電源后，先對金屬電極輸出-3kV電壓，持續(xù)輸出6s；然后對金屬電極輸出+1.75kV電壓。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明實施例至少具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明首先使用反相負高壓對樣品溶液進行預(yù)處理，然后使用正相高壓產(chǎn)生納噴霧，相比于普通nano-ESI而言，本發(fā)明在檢測效果上具有以下優(yōu)勢：

(1)更高的信號強度：待測生物分子的信號強度得到了增強(1-2個數(shù)量級)。

(2)更高的信噪比：所得待測生物分子的質(zhì)譜圖具有更高的信噪比(1-2個數(shù)量級)。對待測分子產(chǎn)生信號增強的同時，有效地抑制了噪音的信號強度，從而使得待測分子的信噪比得到了顯著增強。

(3)對緩沖鹽基質(zhì)的耐受性增強：能夠承受更高濃度的緩沖鹽基質(zhì)。對于普通nano-ESI無法完成檢測的高濃度緩沖鹽基質(zhì)樣品(mM級濃度)，本發(fā)明能夠順利地進行檢測。

(4)在檢測過程中，不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子折疊結(jié)構(gòu)的展開。

(5)裝置和操作簡單，無需額外添加劑和其它預(yù)處理手段。在本發(fā)明中，無需額外添加有機酸，就能夠?qū)崿F(xiàn)信號的顯著增強。并且，本發(fā)明對mM級別的高濃度緩沖鹽基質(zhì)具有較強的耐受性，無需額外預(yù)處理手段，可直接實現(xiàn)對待測分子的檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源的結(jié)構(gòu)以及電壓施加策略示意圖；

圖2a為通過普通納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對10μM細胞色素c的檢測結(jié)果示意圖；

圖2b為圖2a中主峰(帶有8+電荷數(shù)的峰)的放大圖；

圖2c為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對10μM細胞色素c的檢測結(jié)果示意圖；

圖2d為圖2c中主峰(帶有8+電荷數(shù)的峰)的放大圖；

圖3a為通過普通納噴霧離子源對100nM細胞色素c樣品的檢測結(jié)果示意圖；

圖3b為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對100nM細胞色素c的檢測結(jié)果示意圖；

圖3c為通過普通納噴霧離子源對10nM細胞色素c樣品的檢測結(jié)果示意圖；

圖3d為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對10nM細胞色素c的檢測結(jié)果示意圖；

圖3e為通過普通納噴霧離子源對1nM細胞色素c樣品的檢測結(jié)果示意圖；

圖3f為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對1nM細胞色素c的檢測結(jié)果示意圖；

圖4a為通過普通納噴霧離子源對胰島素的檢測結(jié)果示意圖；

圖4b為圖4a中主峰(帶有5+電荷數(shù)的峰)的放大圖；

圖4c為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對胰島素的檢測結(jié)果示意圖；

圖4d為圖4c中主峰(帶有5+電荷數(shù)的峰)的放大圖；

圖5a為通過普通納噴霧離子源對含有NaCl基質(zhì)的胰島素樣品的檢測結(jié)果示意圖；

圖5b為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對含有NaCl基質(zhì)的胰島素樣品的檢測結(jié)果示意圖；

圖6a為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對濃度為10μM細胞色素c樣品檢測后生成的帶有8+電荷的質(zhì)子化的細胞色素c離子[M+8H]⁸⁺的萃取離子色譜圖；

圖6b為通過本發(fā)明基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源產(chǎn)生的納噴霧對濃度為10μM細胞色素c樣品檢測后生成的帶有8+電荷的Na⁺加合離子[M+5H+3Na]⁸⁺的萃取離子色譜圖；

圖6c為圖6a和圖6b當時間上處于第一區(qū)域時所得到的質(zhì)譜圖；

圖6d為圖6a和圖6b當時間上處于第二區(qū)域時所得到的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及其附圖對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

一種基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源，包括

納噴霧噴針，用于裝載樣品溶液；納噴霧噴針的材質(zhì)不限，一般為玻璃或石英；尖端內(nèi)徑與普通納噴霧所需內(nèi)徑一致，為1至10μm。Nano-tip尾端的尺寸不限。

金屬電極，插入到納噴霧噴針內(nèi)，與樣品溶液直接接觸；電極材質(zhì)不限，但應(yīng)具有化學(xué)惰性，不易與樣品溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致腐蝕和溶解。一般為鉑絲。

絕緣端蓋，封堵在納噴霧噴針的尾端，防止漏電；

高壓電源，具有正反雙向輸出功能，與金屬電極連接，連接金屬電極的電線穿過絕緣端蓋。

所述高壓電源的正向輸出電壓范圍為0至+3kV，反向輸出電壓范圍為0至-5kV。

一種基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源的操作方法，包括如下步驟：

S1，從納噴霧噴針的尾端注入樣品溶液；

S2，將金屬電極從納噴霧噴針尾端插入到納噴霧噴針內(nèi)，直至金屬電極與樣品溶液接觸到；

S3，用絕緣端蓋封住納噴霧噴針的尾端并連通高壓電源和金屬電極；

S4，打開高壓電源先對金屬電極輸出-2.5kV至5.0kV電壓，持續(xù)輸出3s至12s；然后對金屬電極輸出+1.5kV至+2.0kV電壓，用于產(chǎn)生納噴霧。更具體的，在打開高壓電源后，先對金屬電極輸出-3kV電壓，持續(xù)輸出6s；然后對金屬電極輸出+1.75kV電壓。與此同時，打開質(zhì)譜檢測器進行數(shù)據(jù)采集。

使用時在納噴霧噴針的尖端對正質(zhì)譜儀的質(zhì)譜進樣口。

下面通過具體的實施例驗證基于極性反轉(zhuǎn)電壓策略的納噴霧離子源的檢測效果。

(1)蛋白質(zhì)細胞色素c的檢測

細胞色素c純品(來源于馬心臟，分子量約為12.4kDa)溶解于超純水中得到濃度為10μM待測樣品溶液。分別使用普通nano-ESI和本發(fā)明的方法對該溶液進行檢測，結(jié)果如圖2所示。

從普通nano-ESI的檢測結(jié)果(圖2a)可以看出，所得質(zhì)譜圖呈現(xiàn)出細胞色素c特有的峰簇，主峰帶有8+電荷數(shù)，顯示出細胞色素c分子處于折疊狀態(tài)。對其中帶有8+電荷數(shù)的主峰進行放大(圖2b)可以看到明顯的Na⁺離子加合物峰，并且加合物的峰強度遠強于質(zhì)子化分子的峰強度。此外，從圖中能觀察到加合不同Na⁺個數(shù)的加合物峰，包括1至6個Na⁺離子。其中，帶有3個Na⁺離子的加合物分子具有最高的信號強度。

為了對檢測效果進行量化，特此對帶有8+電荷的質(zhì)子化細胞色素c分子的信噪比(S/N)進行計算，具體的計算方式如下：

S1，對質(zhì)量范圍在m/z＝1480至1500的噪音信號取平均值，得到目標信號峰左端噪音的平均值。

S2，對質(zhì)量范圍在m/z＝1690至1710的噪音信號取平均值，得到目標信號峰右端噪音的平均值。

S3，對左、右兩端噪音進行平均，得到整體噪音的平均值。

S4，將目標信號峰的信號強度除以整體噪音的平均值，得到最終的S/N。

圖2b中，普通nano-ESI所得的帶有8+電荷的質(zhì)子化峰的S/N為111。

本發(fā)明的檢測效果如圖2c所示。所得質(zhì)譜圖呈現(xiàn)出細胞色素c特有的峰簇，主峰帶有8+電荷數(shù)，表明細胞色素c分子的折疊并未受到破壞。對其中帶有8+電荷數(shù)的主峰進行放大(圖2d)后，并未觀察到明顯Na⁺加合物的峰。這表明本發(fā)明能夠有效地抑制鹽離子加合物對檢測帶來的干擾，對鹽基質(zhì)具有更高的耐受性。從定量結(jié)果可以看出(圖2d)，本發(fā)明所得的帶有8+電荷的質(zhì)子化峰的S/N為2180。與普通nano-ESI相比，本發(fā)明所得的S/N提高了20倍。

(2)低濃度細胞色素c的檢測

在較低濃度下，本發(fā)明對待測分子信號的增強作用更加顯著。我們使用低濃度的細胞色素c樣品對此特性進行了考察。結(jié)果如圖3所示。

從普通nano-ESI的檢測結(jié)果(圖3a，c和e)可以看出，當細胞色素c的濃度為100nM時，普通nano-ESI能夠勉強完成檢測，S/N為3。并且有明顯Na⁺離子加合物的峰出現(xiàn)。當細胞色素c的濃度降低到10nM時，已經(jīng)無法檢出細胞色素c的信號。進一步降低細胞色素c的濃度至1nM時，亦無檢出信號。

對于上述三種濃度的細胞色素c樣品，本發(fā)明均能順利地完成檢測(圖3b，d和f)。當細胞色素c的濃度為100nM時，所得信號的S/N為156，與普通nano-ESI的S/N相比增強了53倍。沒有Na⁺加合物的峰出現(xiàn)。當細胞色素c的濃度降低至10nM時，所得信號的S/N為58。沒有Na⁺加合物的峰出現(xiàn)。當細胞色素c的濃度進一步降低至1nM時，本發(fā)明仍能完成檢測。所得信號的S/N為5。依然沒有Na⁺加合物的峰出現(xiàn)。

(3)蛋白質(zhì)胰島素的檢測

胰島素純品(來源于牛胰腺，分子量約為5.6kDa)溶解于超純水中得到濃度為10μM待測樣品溶液。分別使用普通nano-ESI和本發(fā)明的方法對該溶液進行檢測，結(jié)果如圖4所示。

從普通nano-ESI的檢測結(jié)果可以看出(圖4a)，所得質(zhì)譜圖呈現(xiàn)出胰島素特有的峰簇，主峰帶有5+電荷數(shù)。從主峰的放大圖(圖4b)可以看到明顯的Na⁺離子加合物峰。加合了不同Na⁺個數(shù)的加合物峰均能被辨認出來，包括1至9個Na⁺離子。其中加合5個Na⁺離子的譜峰具有最高強度。由于帶有5+電荷數(shù)的主峰峰簇中并沒有觀察到質(zhì)子化峰，全為Na⁺離子加合物的峰，所以無法與本發(fā)明的檢測結(jié)果進行比較。這也體現(xiàn)出普通nano-ESI在進行胰島素的檢測時，對鹽基質(zhì)的抗干擾能力較為有限?？紤]到在帶有4+電荷的峰簇中，能觀察到一定強度的質(zhì)子化譜峰，因而選用帶有4+電荷的質(zhì)子化峰計算S/N，并與本發(fā)明的檢測結(jié)果進行比較。具體的計算方式如下：

S1，對質(zhì)量范圍在m/z＝1400至1420的噪音信號取平均值，得到目標信號峰左端噪音的平均值。

S2，對質(zhì)量范圍在m/z＝1560至1580的噪音信號取平均值，得到目標信號峰右端噪音的平均值。

S3，對左、右兩端噪音進行平均，得到整體噪音的平均值。

S4，將目標信號峰的信號強度除以整體噪音的平均值，得到最終的S/N。帶有4+電荷的質(zhì)子化峰的S/N為6。

本發(fā)明有效地改善了對胰島素的檢測結(jié)果。從檢測結(jié)果可以看出(圖4c)，所得質(zhì)譜圖呈現(xiàn)出胰島素特有的峰簇，主峰帶有5+電荷數(shù)。在主峰的放大圖中(圖4d)幾乎觀察不到Na⁺離子加合物峰。這說明本發(fā)明對鹽基質(zhì)具有較強的額耐受性。帶有4+電荷的質(zhì)子化峰的S/N為2252。與普通nano-ESI的檢測結(jié)果相比而言，S/N增強了375倍。

(4)對鹽基質(zhì)耐受性的考察

為進一步考察本發(fā)明對鹽基質(zhì)的耐受性，分別使用普通nano-ESI和本發(fā)明對含有NaCl的胰島素樣品進行檢測，并將檢測結(jié)果進行對比。首先，將NaCl固體溶解于超純水中得到濃度為1mM的NaCl基質(zhì)溶液。之后，將胰島素固體溶解于NaCl基質(zhì)溶液中得到濃度為10μM胰島素樣品溶液，用于檢測。

從普通nano-ESI的檢測結(jié)果中(圖5a)可以看到明顯的NaCl團簇離子。這些團簇離子的出現(xiàn)，導(dǎo)致嚴重的離子抑制效應(yīng)，使得胰島素的信號被極大地抑制了。雖然胰島素的信號能夠從圖中能夠勉強辨認出來，但是信號強度較弱，并且有嚴重的Na⁺加合峰出現(xiàn)。

本發(fā)明的檢測效果則有明顯的改善。從本發(fā)明的檢測結(jié)果中(圖5b)可以觀察到胰島素特有的峰簇，主峰帶有5+電荷數(shù)。沒有NaCl團簇離子的出現(xiàn)，這說明在本發(fā)明的檢測過程中，高濃度NaCl所帶來的離子抑制效應(yīng)被有效地消除了。這也驗證了本發(fā)明對mM級別的鹽基質(zhì)具有較強的耐受性。

(5)機理考察

為進一步了解本發(fā)明的特性，我們對本發(fā)明的信號增強和除鹽機理進行了深入探討。機理考察以細胞色素c作為檢測對象。細胞色素c固體溶解于超純水得到濃度為10μM的樣品溶液，直接用于檢測。檢測完成后，分別考察帶有8+電荷的質(zhì)子化的細胞色素c離子[M+8H]⁸⁺的EIC(Extracted ion chromatograms萃取離子色譜圖)和帶有8+電荷的Na⁺加合離子[M+5H+3Na]⁸⁺的EIC(圖6)。

需要說明的是，圖6a和圖6b的坐標圖中的豎線左邊為第一區(qū)域，豎線右邊為第二區(qū)域。

在本發(fā)明的檢測過程中，溶液首先經(jīng)過6s的-3.0kV的負高壓處理(時間從0min開始)。然后，電壓被調(diào)至+1.75kV以產(chǎn)生納噴霧。從此時開始，[M+8H]⁸⁺離子的信號迅速增強，直至達到峰值(圖6a)。之后，[M+8H]8⁺離子的信號逐漸減弱。

帶有8+電荷的Na⁺加合離子[M+5H+3Na]⁸⁺的EIC則具有不同的規(guī)律。該離子代表了溶液中Na⁺的行為。當電壓被調(diào)至+1.75kV以產(chǎn)生納噴霧后，[M+5H+3Na]⁸⁺離子的信號在較長時間內(nèi)保持了較為緩慢的增長，直至在時間上到達紅色區(qū)域后，[M+5H+3Na]⁸⁺離子的信號迎來了較為迅速的增長。與圖a中[M+8H]⁸⁺離子的EIC相比可以看出，兩種離子的峰值出現(xiàn)在不同的時候。質(zhì)子化離子[M+8H]⁸⁺的峰值在較早的時候出現(xiàn)，而Na+加合物[M+5H+3Na]⁸⁺的信號則在一開始處于較低水平，時間上進入第二區(qū)域之后才逐漸增強。

從上述結(jié)果可以看出本發(fā)明的內(nèi)在機理。由于溶液中的待測分子與基質(zhì)鹽離子在溶液中具有不同的電遷移速率，因而在6s時間的負高壓電場的驅(qū)動下所遷移的距離也不一樣。具有較高遷移速率的基質(zhì)鹽離子遷移了較大的距離(向遠離nano-tip尖端的方向)，而待測分子則遷移了較小的距離。當使用正高壓觸發(fā)正常電噴霧之后，待測分子便先與基質(zhì)鹽離子產(chǎn)生較強信號。這便實現(xiàn)了對基質(zhì)鹽離子的去除，增強了本發(fā)明對樣品中基質(zhì)離子的耐受性。同時，由于基質(zhì)鹽離子與待測分子的分離，使得待測分子在離子化的過程中受到的離子抑制相應(yīng)降低，從而也增強了待測分子的離子化效率，進而增強了待測分子的檢出信號。

從圖6中第一時間段所采集到的質(zhì)譜圖(圖6c)可以看出，待測分子具有較強的信號強度，譜峰具有較高的信噪比。在圖中沒有觀察到鹽基質(zhì)離子的加合物峰。而在第二時間段所采集到的質(zhì)譜圖(圖6d)可以看到待測分子的信號受到了明顯的干擾。圖中有明顯的鹽離子Na+離子加合物的峰，并且細胞色素c的整體信號減弱了，譜峰具有較低的信噪比。圖6c和圖6d兩張質(zhì)譜圖的顯著差異進一步佐證了上述對EIC的考察中所得到的結(jié)論。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護范圍為準。