檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的pcr方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo) 的PCR方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠟樣芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌，在自然界中分布廣泛，常存 在于土壤、灰塵、污水中，植物和許多生熟食品中常見(jiàn)。目前已從多種食品種分離出該菌，包 括肉、乳制品、蔬菜、魚(yú)、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點(diǎn)等。人類(lèi)食用受蠟樣芽孢 桿菌污染的食物可能引起食物中毒，癥狀通常表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道感染癥狀， 也可導(dǎo)致胃腸外感染，如腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎和全身性感染等。我國(guó)每年都有很多因食 用受蠟樣芽孢桿菌污染的食品而導(dǎo)致的食物中毒事件，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康。因 此，建立一種能快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法，對(duì)我國(guó)人民的公共衛(wèi)生安全具 有重要意義。
[0003] 目前蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time PCR) 方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法和酶 聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)等。我國(guó)賭樣芽孢桿菌的 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（GB 4789. 14-2014)以及出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 0176-2013) 都采用的是培養(yǎng)法，需要經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)、分離純培養(yǎng)、生化鑒定等實(shí)驗(yàn)過(guò)程，耗時(shí)費(fèi)力特異 性不強(qiáng)，對(duì)于仍然具有致病性的"活的非可培養(yǎng)狀態(tài)"（Viable But Non-Culturable，VBNC) 的細(xì)菌敏感性較低，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于上述各種方法的不足，本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)周期 短、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的試劑盒 及方法，可在Id之內(nèi)得到結(jié)果，同時(shí)無(wú)需昂貴的儀器和復(fù)雜的試劑，避免因?yàn)闃悠反嬖贒NA 聚合酶的抑制因子而得到假陰性結(jié)果，可用于多種食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)等。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：
[0006] -種檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR方法及試劑盒，其特殊之處在 于：
[0007] 該試劑盒包含：無(wú)菌去離子水，PCR反應(yīng)預(yù)混液，對(duì)照品：
[0008] 所述PCR反應(yīng)預(yù)混液含有PCR反應(yīng)緩沖液，MgCl2，脫氧核糖核苷三磷酸，檢測(cè)用引 物，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)照Taq DNA聚合酶，DNA染料；
[0009] 所述檢測(cè)用引物為如下4條引物的混合物：
[0010] A：AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG
[0011] B:CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC
[0012] C：GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG
[0013] D:CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG
[0014] 所述對(duì)照品分為陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，陰性對(duì)照品為引物C和引物D為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的重組質(zhì)粒，陽(yáng)性對(duì)照品為混合質(zhì)粒。
[0015] 所述重組質(zhì)粒的制備方法是：分別用A/B和C/D兩對(duì)引物與相應(yīng)的模板DNA進(jìn)行 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接至PMD 19 (simple)-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10感受 態(tài)細(xì)胞，接種至含抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，PCR篩選陽(yáng)性菌落后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。取經(jīng)驗(yàn)證后 序列正確無(wú)誤的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再把兩種質(zhì)粒進(jìn)行混合，作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0016] 一種檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR方法，其具體操作步驟是：
[0017] (a)樣品的米集：無(wú)菌米集可疑食品；
[0018] (b)增菌培養(yǎng)：將采集的可疑食品混合均勻后無(wú)菌取樣25g，放入無(wú)菌研缽、組織 研磨器內(nèi)研磨碎或放入均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2min，加入無(wú)菌的LB培養(yǎng)基225ml，37 ± I °C振蕩培養(yǎng) l〇h，得增菌液；
[0019] ((3)0嫩提?。喝∨囵B(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取1.51111于離心管中100017^11離心 lmin，除去較大塊的食品碎片，取上清10000r/min離心10min，除去上清液，用無(wú)菌去離子 水重懸、洗絳沉淀，l〇〇〇〇r/min離心10min，棄上清，用少量無(wú)菌去離子水重懸沉淀，沸水浴 5min，冰浴5min，取上清液，得樣品模板DNA ;
[0020] (d)PCR反應(yīng)管制備：PCR反應(yīng)管的制備及PCR反應(yīng)預(yù)混液的融化置于冰上進(jìn)行。 依次取PCR反應(yīng)預(yù)混液24ul、樣品模板DNA Iul加入至PCR反應(yīng)管中混合均勻，制得樣品模 板DNA的PCR反應(yīng)管；按樣品模板DNA的PCR反應(yīng)管的制備方法依次制備陰性對(duì)照品和陽(yáng) 性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管；陰性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管中的樣品模板DNA用試劑盒中的陰性對(duì) 照品代替，陽(yáng)性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管中的樣品模板DNA用試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照品代替； 每擴(kuò)增一次都要至少有一管陰性對(duì)照和一管陽(yáng)性對(duì)照。
[0021] (e)擴(kuò)增檢測(cè)：將制備好的樣品模板DNA、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管置 于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR的具體反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min ;94°C 變性30s，51. 2°C退火30s，72°C延伸75s，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0022] (f)檢測(cè)結(jié)果判定：取I. 5g瓊脂糖溶于IOOrnl電泳緩沖液中，混合均勻后煮沸，冷 卻，傾倒凝膠板；凝膠冷卻凝固后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2-5ul加入凝膠孔中進(jìn)行電泳；電泳結(jié) 束后，將凝膠放置于紫外燈下觀察，判定結(jié)果：①陽(yáng)性對(duì)照的凝膠孔有2條電泳條帶而陰性 對(duì)照的凝膠孔有1條帶，則PCR反應(yīng)檢測(cè)成功；②若陽(yáng)性對(duì)照的凝膠孔有2條帶，陰性對(duì)照 有1條帶，被檢樣品無(wú)條帶，則說(shuō)明提取的DNA中含有抑制PCR反應(yīng)的因素，建議重新提取 DNA后再進(jìn)行檢測(cè)；③若陰性對(duì)照有2條帶，說(shuō)明PCR反應(yīng)管制備過(guò)程中有交叉污染，結(jié)果 不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測(cè)；④陽(yáng)性對(duì)照有2條帶，陰性對(duì)照有1條帶，被檢樣品的凝 膠孔只出現(xiàn)1條約1164bp的電泳條帶與陽(yáng)性對(duì)照的凝膠孔相應(yīng)條帶大小一致，則結(jié)果判斷 為陰性；⑤被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)的2條電泳條帶與陽(yáng)性對(duì)照的凝膠孔中相應(yīng)條帶大小一 致，陰性對(duì)照有1條帶，則判定為被檢樣品陽(yáng)性。
[0023] 所LB培養(yǎng)基是采用胰蛋白胨10g、酵母5g、氯化鈉 IOg及蒸餾水1000ml，加熱攪拌 溶解，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0,在121 °C高壓蒸汽滅菌20min制得。
[0024] 所述電泳的條件為電場(chǎng)強(qiáng)度5V/cm，電泳時(shí)間40min。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，本試劑盒及檢測(cè)方法使用方便、可靠 性好、檢測(cè)周期短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作步驟簡(jiǎn)單，適用于高通量操作、標(biāo)準(zhǔn) 化操作，又能鑒別因試劑中存在PCR反應(yīng)抑制成分而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，對(duì)提高食品安全 水平具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1檢測(cè)成功的結(jié)果；
[0027] 圖2提取的DNA中有PCR抑制劑時(shí)擴(kuò)增得到的結(jié)果；
[0028] 圖3 PCR反應(yīng)管制備過(guò)程中有交叉污染時(shí)擴(kuò)增得到的結(jié)果；
[0029] 圖4檢測(cè)樣品中蠟樣芽孢桿菌陰性時(shí)擴(kuò)增得到的結(jié)果；
[0030] 圖5檢測(cè)樣品被蠟樣芽孢桿菌污染，擴(kuò)增呈陽(yáng)性時(shí)得到的結(jié)果。
[0031] 圖中：M-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；陽(yáng)-陽(yáng)性對(duì)照品；陰-陰性對(duì)照品；檢-檢測(cè)的可疑樣 品。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例
[0033] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0034] 1.采集食品樣品，混合均勾后無(wú)菌采集25g或25ml，用無(wú)菌均質(zhì)袋均質(zhì)2min，與 225ml無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基混合，置于37±1°C增菌培養(yǎng)8-1