本發(fā)明涉及小麥葉片的處理技術(shù)以及計算機視覺技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法。

背景技術(shù)：

氣孔是植物與外界環(huán)境之間進(jìn)行氣體交換(如二氧化碳和水蒸汽等)的重要通道,在植物的光合作用、蒸騰作用以及水分利用中發(fā)揮著巨大的作用。一般來說氣孔由兩個腰果狀的保衛(wèi)細(xì)胞組成，它們形成一個可以開閉的孔。氣孔是高等植物表皮所特有的結(jié)構(gòu)。一般氣孔位于植物葉片的背面，如薔薇花科植物蘋果；禾本科植物葉片兩面都有氣孔，如小麥；但一些水生植物，如睡蓮，氣孔只分布于葉片正面。在細(xì)胞學(xué)、植物生理學(xué)的研究中，常常需要測定葉片下表皮氣孔的分布、形狀和大小等。常用方法有徒手直接撕取葉片法、印跡法。直接用鑷子撕取植物材料的表皮制作成臨時裝片，在顯微鏡下觀察，此法操作簡便，耗時短，但是此法得到的臨時裝片往往由于氣孔關(guān)閉而無法得到真實的氣孔狀況，還有一些材料往往不能靠直接撕取而獲得葉片表皮；利用印跡法獲得葉片下表皮結(jié)構(gòu)，得到的圖像中細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，真實度較好，有利于研究植物器官發(fā)育過程中植物細(xì)胞大小及數(shù)目的變化，但是此法操作費時，不能夠觀察到氣孔的細(xì)微結(jié)構(gòu)，為此，我們提出了一種基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法，以解決上述問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法，該基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法的具體步驟如下：

S1：挑選籽粒飽滿的小麥種，置于小燒杯中先用蒸餾水沖洗三次，并用75％的酒精溶液浸泡1min，然后再用蒸餾水沖洗三次，每次1min,除去小麥種子上的酒精殘留，沖洗后再用蒸餾水浸泡45～60min，之后再用蒸餾水沖洗一次；

S2：浸泡后將種子分裝在培養(yǎng)皿中，并放置在恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫溫度25℃，濕度為33％，且在小麥種培養(yǎng)期間早、中、晚定時加水換水，每天記錄小麥的發(fā)芽率，培養(yǎng)15天左右；

S3：將培養(yǎng)后的小麥苗的第二片葉從根部剪下若干，并將葉片用清水沖洗后再用蒸餾水進(jìn)行清洗，之后用吸水紙吸干，擺放整齊后備用；

S4：將透明塑料膠帶拉開10～15cm，膠面朝上平放在實驗臺面上，捏住葉片被剪端，將葉片正面粘在膠帶上并將葉片對折粘在葉片的背面，使膠帶與葉片的兩端緊密粘接；

S5：將對折的膠帶撕開，將粘有葉片下表皮的膠帶沿表皮輪廓剪成1cm×1cm的正方形膠片，并在載玻片上滴2滴蒸餾水和1滴1％的碘-碘化鉀染液，將粘有葉片下表皮的膠帶膠面向下放在載玻片上，染色1min，并蓋上玻片；

S6：調(diào)節(jié)數(shù)碼顯微鏡，放大倍數(shù)40×10，并導(dǎo)入顯微鏡圖像處理軟件系統(tǒng)進(jìn)行拍照，對氣孔形態(tài)進(jìn)行觀察；

S7：對顯微鏡圖像采用多聚焦圖像融合技術(shù)進(jìn)行處理，將多張不同焦距的圖像經(jīng)過融合處理后，提取各自的清晰信息綜合成一幅新的視場范圍更大清晰范圍更大的圖像，便于人眼進(jìn)行觀察；

S8：針對處理后的顯微鏡圖像進(jìn)行圖像識別，并統(tǒng)計圖像上的氣孔數(shù)量，根據(jù)葉片的實際尺寸，得到實際的氣孔密度。

優(yōu)選的，所述步驟S2中，在培養(yǎng)皿的底部墊上一層濾紙，避免水分蒸發(fā)過快，同時用保鮮膜將培養(yǎng)皿包裹后在其頂部保鮮膜上針扎若干小孔，便于小麥種呼吸。

優(yōu)選的，所述步驟S4中，左手捏住葉片被剪的一端使葉片正面粘在膠帶上，在粘貼過程中先將葉片粘貼在膠帶上，然后將葉片向葉正面彎曲并逐漸向前慢慢推進(jìn)，使葉片正面與膠帶充分接觸，為了防止粘貼過程中葉片皺縮，應(yīng)右手拿解剖針置于葉片與膠帶之間進(jìn)行調(diào)整，使葉片平整的粘貼在膠帶上，將膠帶對折粘在葉片的背面并用手指對捏膠帶使葉片與膠帶之間緊密粘接。

優(yōu)選的，所述步驟S5中，在膠帶揭開的過程中，葉片的正面仍粘在膠帶上，背面與膠帶分離，將葉片下表皮粘在膠帶上。

優(yōu)選的，所述步驟S6中，在對葉片的氣孔形態(tài)特征進(jìn)行觀察時，將葉片制成3個臨時裝片在40×10倍數(shù)碼顯微鏡下觀察，每一裝片上選取10個視野進(jìn)行拍照，即每個葉片共30幅圖片。

優(yōu)選的，所述步驟S7中，在多聚焦圖像融合技術(shù)針對圖像邊緣的檢測中，應(yīng)用一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行，其中一階導(dǎo)數(shù)用于檢測圖像中的一個點是否為邊緣的一個點，并通過二階導(dǎo)數(shù)正負(fù)極值的虛擬連線的過零點來判斷出邊緣的中點。

優(yōu)選的，所述步驟S8中，在顯微鏡的圖像識別過程中，根據(jù)圖像的像素灰度、RGB值和頻譜的圖像基本特征進(jìn)行識別。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明操作簡單，耗時短，適合研究栽培作物氣孔的動態(tài)變化，針對采集的葉片標(biāo)本采用顯微圖像處理的方式進(jìn)行觀察葉片表面的氣孔密度，其結(jié)果準(zhǔn)確率較高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明工作流程圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請參閱圖1，本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法，該基于顯微圖像的小麥葉片氣孔密度測量方法的具體步驟如下：

S1：挑選籽粒飽滿的小麥種，置于小燒杯中先用蒸餾水沖洗三次，并用75％的酒精溶液浸泡1min，然后再用蒸餾水沖洗三次，每次1min,除去小麥種子上的酒精殘留，沖洗后再用蒸餾水浸泡45～60min，之后再用蒸餾水沖洗一次；

S2：浸泡后將種子分裝在培養(yǎng)皿中，并放置在恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫溫度25℃，濕度為33％，且在小麥種培養(yǎng)期間早、中、晚定時加水換水，每天記錄小麥的發(fā)芽率，培養(yǎng)15天左右，在培養(yǎng)皿的底部墊上一層濾紙，避免水分蒸發(fā)過快，同時用保鮮膜將培養(yǎng)皿包裹后在其頂部保鮮膜上針扎若干小孔，便于小麥種呼吸；

S3：將培養(yǎng)后的小麥苗的第二片葉從根部剪下若干，并將葉片用清水沖洗后再用蒸餾水進(jìn)行清洗，之后用吸水紙吸干，擺放整齊后備用；

S4：將透明塑料膠帶拉開10～15cm，膠面朝上平放在實驗臺面上，捏住葉片被剪端，將葉片正面粘在膠帶上并將葉片對折粘在葉片的背面，使膠帶與葉片的兩端緊密粘接，左手捏住葉片被剪的一端使葉片正面粘在膠帶上，在粘貼過程中先將葉片粘貼在膠帶上，然后將葉片向葉正面彎曲并逐漸向前慢慢推進(jìn)，使葉片正面與膠帶充分接觸，為了防止粘貼過程中葉片皺縮，應(yīng)右手拿解剖針置于葉片與膠帶之間進(jìn)行調(diào)整，使葉片平整的粘貼在膠帶上，將膠帶對折粘在葉片的背面并用手指對捏膠帶使葉片與膠帶之間緊密粘接；

S5：將對折的膠帶撕開，將粘有葉片下表皮的膠帶沿表皮輪廓剪成1cm×1cm的正方形膠片，并在載玻片上滴2滴蒸餾水和1滴1％的碘-碘化鉀染液，將粘有葉片下表皮的膠帶膠面向下放在載玻片上，染色1min，并蓋上玻片，在膠帶揭開的過程中，葉片的正面仍粘在膠帶上，背面與膠帶分離，將葉片下表皮粘在膠帶上；

S6：調(diào)節(jié)數(shù)碼顯微鏡，放大倍數(shù)40×10，并導(dǎo)入顯微鏡圖像處理軟件系統(tǒng)進(jìn)行拍照，對氣孔形態(tài)進(jìn)行觀察，在對葉片的氣孔形態(tài)特征進(jìn)行觀察時，將葉片制成3個臨時裝片在40×10倍數(shù)碼顯微鏡下觀察，每一裝片上選取10個視野進(jìn)行拍照，即每個葉片共30幅圖片；

S7：對顯微鏡圖像采用多聚焦圖像融合技術(shù)進(jìn)行處理，將多張不同焦距的圖像經(jīng)過融合處理后，提取各自的清晰信息綜合成一幅新的視場范圍更大清晰范圍更大的圖像，便于人眼進(jìn)行觀察，在多聚焦圖像融合技術(shù)針對圖像邊緣的檢測中，應(yīng)用一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行，其中一階導(dǎo)數(shù)用于檢測圖像中的一個點是否為邊緣的一個點，并通過二階導(dǎo)數(shù)正負(fù)極值的虛擬連線的過零點來判斷出邊緣的中點；

S8：針對處理后的顯微鏡圖像進(jìn)行圖像識別，并統(tǒng)計圖像上的氣孔數(shù)量，根據(jù)葉片的實際尺寸，得到實際的氣孔密度，在顯微鏡的圖像識別過程中，根據(jù)圖像的像素灰度、RGB值和頻譜的圖像基本特征進(jìn)行識別。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。