本發(fā)明涉及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

隨著全球氣候變暖，熱應(yīng)激對(duì)畜牧業(yè)的影響越來(lái)越嚴(yán)重。而我國(guó)幅員遼闊，每年夏季大片區(qū)域受熱應(yīng)激影響，導(dǎo)致畜禽代謝紊亂、生產(chǎn)性能和繁殖性能降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。熱應(yīng)激反應(yīng)是動(dòng)物機(jī)體一種自我保護(hù)機(jī)制，相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變。研究表明，熱應(yīng)激對(duì)奶牛的多數(shù)免疫指標(biāo)有重要影響。多數(shù)有關(guān)緩解熱應(yīng)激發(fā)生的研究措施主要是從營(yíng)養(yǎng)角度出發(fā)。關(guān)于體外分子診斷的研究方法卻較少。

微小RNA(microRNA，即miRNA)通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能。miRNA分子廣泛參與到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡的各個(gè)環(huán)節(jié)，并與動(dòng)物生理狀態(tài)的改變以及疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNA在哺乳動(dòng)物泌乳過(guò)程中也起著重要的作用。

miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，在哺乳動(dòng)物基因的轉(zhuǎn)錄水平中只有1％～5％被編碼，卻調(diào)控超過(guò)60％的基因。miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡，機(jī)體免疫和抗應(yīng)激反應(yīng)、生長(zhǎng)性能和繁殖性能等多方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法。

一種熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

步驟一、熱應(yīng)激奶牛與非熱應(yīng)激奶牛乳腺組織樣本采集；

步驟二、Solexa高通量測(cè)序鑒定參與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)的miRNA，尋找差異表達(dá)miRNA；

步驟三、差異表達(dá)顯著的miRNA靶基因預(yù)測(cè)；

步驟四、差異表達(dá)顯著的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟一中，熱應(yīng)激奶牛與非熱應(yīng)激奶牛乳腺組織樣本采集，根據(jù)系譜資料、奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定體系DHI數(shù)據(jù)和牛場(chǎng)記錄數(shù)據(jù)，選取性別相同，飼養(yǎng)環(huán)境、年齡及胎次相近的4頭熱應(yīng)激奶牛和4頭非熱應(yīng)激奶牛作為實(shí)驗(yàn)牛，采集乳腺組織樣本放入液氮中，到實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二包括如下步驟：

(a)用Trizol試劑提取熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期奶牛乳腺組織總RNA并鑒定；

(b)采用TA克隆和傳統(tǒng)Sanger測(cè)序?qū)λ峥俁NA鑒定是否可用于Solexa測(cè)序，建立小RNA文庫(kù)，并進(jìn)行測(cè)序分析驗(yàn)證；

(c)分離長(zhǎng)度18-30nt范圍的小RNA，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后用Solexa測(cè)序儀對(duì)DNA片段進(jìn)行單向末端直接測(cè)序；

(d)對(duì)所測(cè)的原始序列進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)；

(e)將步驟(d)處理過(guò)的序列與已知庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)分析并分類注釋；

(f)鑒定已知miRNA和預(yù)測(cè)新miRNA；

(g)尋找差異表達(dá)miRNA。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二第(a)條包括以下內(nèi)容：

①取-70℃凍存組織約100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol試劑混勻；

②樣品中加入Trizol試劑后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解，室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離；

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘；

④4℃12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色水相，RNA主要在水相中，把水相(約600μl)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的RNase-Free離心管中；

⑤在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘；

⑥4℃12000rpm離心10分鐘，棄上清；

⑦加入1ml 75％乙醇(用無(wú)RNase的水配制)洗滌沉淀；

⑧4℃12000rpm離心3分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉淀；

⑨室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30μL無(wú)RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解；

⑩由1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA提取結(jié)果，用生物分析儀分析RNA的完整性和濃度。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二第(d)條包括以下內(nèi)容：

通過(guò)去接頭、去污染、統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度分布等過(guò)程，獲得去雜質(zhì)的“干凈”序列(Clean序列)。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二第(e)條包括以下內(nèi)容：

將Clean序列通過(guò)與NCBI Genbank(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)中rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat、exon、intron和miRNA等庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)分析并分類注釋。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二第(f)條包括以下內(nèi)容：

根據(jù)牛、人、豬、犬、大猩猩和老鼠等哺乳動(dòng)物已經(jīng)注冊(cè)的miRNA分子信息，用同源搜索的計(jì)算分析方法預(yù)測(cè)牛新的候選miRNA，通過(guò)堿基錯(cuò)配、二級(jí)結(jié)構(gòu)、A+U含量、自由能大小等分析候選序列特征，鑒定已知miRNA和預(yù)測(cè)新miRNA。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟二第(g)條包括以下內(nèi)容：

將測(cè)序樣品測(cè)序量歸一化到同一個(gè)量級(jí)，使用標(biāo)準(zhǔn)化后的結(jié)果統(tǒng)計(jì)倍數(shù)變化和P值，定義差異表達(dá)miRNA的P值＜0.01、FDR＜0.05，尋找差異表達(dá)miRNA。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟三包括以下內(nèi)容：

對(duì)差異表達(dá)顯著的miRNA，通過(guò)應(yīng)用含有預(yù)編譯的Miranda算法結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)MicroCosm(http:www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)以及預(yù)測(cè)軟件TargetScan 6.0(http://www.Targetscan.org/)分別獲得2個(gè)預(yù)測(cè)軟件的靶基因集，并求取2個(gè)靶基因集的交集作為差異miRNA調(diào)控的全體靶基因。

進(jìn)一步的，所述的熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法，步驟四包括以下內(nèi)容：

應(yīng)用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)網(wǎng)站(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)差異miRNA調(diào)控的差異靶基因進(jìn)行GO分析和Pathway分析，確定預(yù)測(cè)靶基因參與的生物過(guò)程及最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等生物學(xué)功能，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以P＜0.01、FDR＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明以熱應(yīng)激奶牛乳腺和正常奶牛乳腺為試驗(yàn)材料，采用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出兩種乳腺中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)一步驗(yàn)證分析，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)中差異表達(dá)miRNA靶基因并分析其信號(hào)通路，構(gòu)建miRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。揭示高溫環(huán)境下miRNA的調(diào)控作用及其機(jī)制，為調(diào)控或減弱奶牛的熱應(yīng)激反應(yīng)，以及提高產(chǎn)奶量提供新的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，對(duì)開發(fā)熱應(yīng)激蛋白質(zhì)飼料、調(diào)控奶牛環(huán)境等方面也具有非常重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為RNA的Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)結(jié)果

圖2為差異表達(dá)的已知miRNA的靶基因位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。

一種熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)miRNAs基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，包括如下步驟：

步驟一、熱應(yīng)激奶牛與非熱應(yīng)激奶牛乳腺組織樣本采集。

根據(jù)系譜資料、DHI數(shù)據(jù)和牛場(chǎng)記錄數(shù)據(jù)，選取性別相同，飼養(yǎng)環(huán)境、年齡及胎次相近的4頭熱應(yīng)激奶牛(夏季，8月)和4頭非熱應(yīng)激奶牛(春季，3月)作為實(shí)驗(yàn)牛，采集乳腺組織樣本放入液氮中，到實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟二、Solexa高通量測(cè)序鑒定參與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)的miRNA，尋找差異表達(dá)miRNA。

(a)用Trizol試劑提取熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激期奶牛乳腺組織總RNA并鑒定。提取步驟如下：

①取-70℃凍存組織約100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol試劑混勻。

②樣品中加入Trizol試劑后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘。

④4℃12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色水相，RNA主要在水相中，把水相(約600μl)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的RNase-Free離心管中。

⑤在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。

⑥4℃12000rpm離心10分鐘，棄上清。

⑦加入1ml 75％乙醇(用無(wú)RNase的水配制)洗滌沉淀。

⑧4℃12000rpm離心3分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉淀。

⑨室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30μL無(wú)RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

⑩由1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA提取結(jié)果，用生物分析儀分析RNA的完整性和濃度。由圖1可知，樣品總RNA濃度為235ng/μL，28S:18S約為2.0，RNA完整性(RIN)為8.4，達(dá)到了文庫(kù)構(gòu)建的要求，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

(b)建立小RNA文庫(kù)，并進(jìn)行測(cè)序分析驗(yàn)證。

采用TA克隆和傳統(tǒng)Sanger測(cè)序?qū)λ峥俁NA鑒定是否可用于Solexa測(cè)序。建立了小RNA文庫(kù)，并進(jìn)行了測(cè)序分析。

(c)用Solexa測(cè)序儀對(duì)DNA片段進(jìn)行單向末端直接測(cè)序。

分離長(zhǎng)度18-30nt范圍的小RNA，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后用Solexa測(cè)序儀對(duì)DNA片段進(jìn)行單向末端直接測(cè)序。

(d)對(duì)所測(cè)的原始序列進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)；

共獲得21,684,303個(gè)高質(zhì)量序列，通過(guò)去接頭、去污染、統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度分布等過(guò)程，獲得去雜質(zhì)的“干凈”序列(Clean序列)21,042,828個(gè)，占所有小RNA的97.04％。

(e)將步驟(d)處理過(guò)的序列與已知庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)分析并分類注釋；

將Clean序列通過(guò)與NCBI Genbank(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)中rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat、exon、intron和miRNA等庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和分類注釋。87.62％為已知的miRNA，只有3.73％為tRNAs、snRNAs、rRNA和snoRNAs。

(f)鑒定已知miRNA和預(yù)測(cè)新miRNA。

根據(jù)牛、人、豬、犬、大猩猩和老鼠等哺乳動(dòng)物已經(jīng)注冊(cè)的miRNA分子信息，用同源搜索的計(jì)算分析方法預(yù)測(cè)牛新的候選miRNA，通過(guò)堿基錯(cuò)配、二級(jí)結(jié)構(gòu)、A+U含量、自由能大小等分析候選序列特征。發(fā)現(xiàn)已知miRNAs 483個(gè)，新miRNAs 139個(gè)。

(g)尋找差異表達(dá)miRNA。

將測(cè)序樣品測(cè)序量歸一化到同一個(gè)量級(jí)，使用標(biāo)準(zhǔn)化后的結(jié)果統(tǒng)計(jì)倍數(shù)變化和P值。定義差異表達(dá)miRNA的P值＜0.01、FDR＜0.05。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA27個(gè)，其中已知miRNA 24個(gè)，新miRNA 3個(gè)(如表1所示)；上調(diào)miRNA20個(gè)，下調(diào)miRNA7個(gè)，豐富了奶牛miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。

表1 差異表達(dá)新miRNA

步驟三、差異表達(dá)顯著的miRNA靶基因預(yù)測(cè)。

對(duì)差異表達(dá)顯著的miRNA，通過(guò)應(yīng)用含有預(yù)編譯的miRanda算法結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)MicroCosm(http:www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)以及預(yù)測(cè)軟件TargetScan 6.0(http://www.Targetscan.org/)分別獲得2個(gè)預(yù)測(cè)軟件的靶基因集，并求取2個(gè)靶基因集的交集作為差異miRNA調(diào)控的全體靶基因，24個(gè)差異表達(dá)的miRNA共有65625個(gè)靶基因，靶基因位點(diǎn)數(shù)為293949個(gè)，如圖2所示。

新發(fā)現(xiàn)的novel-miR-278在熱應(yīng)激組奶牛乳腺組織中表達(dá)下降，其預(yù)測(cè)靶基因HSP40作為HSP70蛋白的一種共伴侶分子，調(diào)節(jié)HSP70的ATP酶活性促進(jìn)HSP70蛋白完成許多細(xì)胞過(guò)程，包括新生蛋白質(zhì)的折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的解折疊、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝和解離過(guò)程。novel-miR-278靶向調(diào)節(jié)的另一個(gè)基因是IFNAR2(干擾素α/β受體β鏈)。干擾素(Interferon,IFN)是一種具有抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。干擾素受體與之結(jié)合可轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)信號(hào),從而啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果表明，這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNAs在熱應(yīng)激條件下可能通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，參與機(jī)體免疫和抗應(yīng)激反應(yīng)。

步驟四、差異表達(dá)顯著的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

為了進(jìn)一步研究組織差異表達(dá)miRNAs的生物學(xué)功能，應(yīng)用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)網(wǎng)站(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)差異miRNA調(diào)控的差異靶基因進(jìn)行GO分析和Pathway分析，確定預(yù)測(cè)靶基因參與的生物過(guò)程及最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等生物學(xué)功能。以P＜0.01、FDR＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

表2 miRNA差異表達(dá)靶基因GO富集分析(靶基因數(shù)>6000)

表3 miRNA靶基因的KEGG通路分析

通過(guò)對(duì)奶牛熱應(yīng)激基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，Wnt、TGF-β、MAPK、Notch和JAK-STAT信號(hào)通路等廣泛參與了奶牛熱應(yīng)激。大多情況下MAPK通常作為執(zhí)行者發(fā)揮主要調(diào)控作用，TGF-β作為激活其他信號(hào)通路的領(lǐng)導(dǎo)者，Wnt信號(hào)通路起協(xié)調(diào)作用，而Notch和JAK-STAT信號(hào)通路起微調(diào)作用。我們對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行KEGG分析中這六個(gè)信號(hào)通路都有發(fā)現(xiàn)，其中MAPK信號(hào)通路中相關(guān)的預(yù)測(cè)的靶基因占0.23％，Wnt信號(hào)通路占1.65％，TGF-β信號(hào)通路占0.71％，Notch信號(hào)通路占0.58％，JAK-STAT信號(hào)通路占1.22％。這些靶基因所對(duì)應(yīng)的miRNA是研究奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)中的重要候選miRNA。

SEQUENCE LISTING

<110> 廊坊師范學(xué)院

<120> 一種熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-278

<400> 1

aacaggcggg ugcugauacg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-383

<400> 2

gaggcggggg ucgcucucuu u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-504

<400> 3

ucacugggca uccucugcuu u 21