一種環(huán)狀RNA引物的設(shè)計(jì)方法與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專(zhuān)利>計(jì)算;推算;計(jì)數(shù)設(shè)備的制造及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種設(shè)計(jì)方法，具體涉及一種環(huán)狀rna引物的設(shè)計(jì)方法。

背景技術(shù)：

環(huán)狀rna(circrna)是區(qū)別于傳統(tǒng)線性rna的一類(lèi)新型非編碼rna，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與線性rna不同的是，circrna沒(méi)有3'或5'端，也沒(méi)有多聚a尾等結(jié)構(gòu)，有保守序列，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，目前的研究證實(shí)了環(huán)狀rna在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控起到重要作用。

由于circrna和線性rna具有相同的核苷酸序列，如果在pcr過(guò)程中利用傳統(tǒng)的方法設(shè)計(jì)引物，則會(huì)把兩者的序列都擴(kuò)增出來(lái)。因此目前解決這個(gè)問(wèn)題的方法就是rna首尾連接處設(shè)計(jì)背靠背引物，即使上游引物和下游引物是呈背靠背反方向擴(kuò)增(傳統(tǒng)的引物是上游引物和下游引物的擴(kuò)增方向呈面對(duì)面擴(kuò)增)。但目前最常用的設(shè)計(jì)方法就是找出序列后，先在word文檔打開(kāi)，在序列5端和3端各找數(shù)百堿基的序列，然后3端的序列和5端序列連接后形成一段新的序列，計(jì)算出連接點(diǎn)所在的位點(diǎn)，再用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)，方法十分繁雜。所以申請(qǐng)人為解決這現(xiàn)狀，發(fā)明一種更加簡(jiǎn)單容易的設(shè)計(jì)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前環(huán)狀rna(circ-rna)是醫(yī)學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域，但是circ-rna的引物的具體設(shè)計(jì)方法并沒(méi)有明確具體的報(bào)道，大多數(shù)的研究者的設(shè)計(jì)方法較為繁瑣復(fù)雜。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種設(shè)計(jì)環(huán)狀rna引物的方法，既滿(mǎn)足環(huán)狀rna背靠背引物的特點(diǎn)，又簡(jiǎn)單容易操作。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種環(huán)狀rna引物的設(shè)計(jì)方法，所述設(shè)計(jì)方法包括以下步驟：

(1)在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目的環(huán)狀rna的dna序列；

(2)取兩條查找到的dna序列，將其中一條dna序列的3’端與另一條dna序列的5’端連接，形成一條新的dna序列；

(3)在新的dna序列上距離步驟(2)中3’端與5’端連接處300個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)目的環(huán)狀rna的上游引物和下游引物，所述上游引物位于所述新的dna序列上所述連接處的上游，所述下游引物位于所述新的dna序列上所述連接處的下游；

(4)將步驟(3)中設(shè)計(jì)的上游引物和下游引物分別進(jìn)行blast，如果該上游引物和下游引物均不能擴(kuò)增線性rna分子，則為最終設(shè)計(jì)的引物。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中數(shù)據(jù)庫(kù)為circbase數(shù)據(jù)庫(kù)。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中設(shè)計(jì)的軟件為primerpremier5。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中上、下游引物長(zhǎng)度分別為18-23bp。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中上、下游引物的擴(kuò)增長(zhǎng)度為70-300bp。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中上、下游引物的gc比例分別為40％-60％。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中目的環(huán)狀rna為hsa_circ_0001727。

本發(fā)明提供了一種采用上述所述方法設(shè)計(jì)的引物。

優(yōu)選地，所述引物包括seqidno:3和seqidno:4所示的引物序列。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)環(huán)狀rna引物的方法，目前針對(duì)環(huán)狀rna設(shè)計(jì)的背靠背引物并沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定，常用的方法需要在word文檔上對(duì)序列做反復(fù)的拼接，且還要在primerpremier5軟件上算連接點(diǎn)的位置，一方面容易在繁雜的過(guò)程中出錯(cuò)，出錯(cuò)又不容易發(fā)現(xiàn)，另一方面繁雜的設(shè)計(jì)過(guò)程增加時(shí)間負(fù)擔(dān)。而本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)單有效，既節(jié)省設(shè)計(jì)時(shí)間，又容易學(xué)習(xí)不容易出錯(cuò)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中環(huán)狀rna的線性rna示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中環(huán)狀rna的示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中兩條相同的rna序列連接形成新的rna序列前的示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中兩條相同的rna序列連接形成新的rna序列后的示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中設(shè)計(jì)環(huán)狀rna引物的流程圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中分別以陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組為模板采用zkscan1(線性rna)的引物(seqidno:5和seqidno:6)和采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物(seqidno:3和seqidno:4)擴(kuò)增的結(jié)果；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中分別采用線性rna的引物(seqidno:5和seqidno:6)和本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna的引物(seqidno:3和seqidno:4)并以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板做普通pcr的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

1、環(huán)狀rna引物設(shè)計(jì)原理：

如圖1和2所示，若設(shè)計(jì)圖一的背靠背引物時(shí)，由于pcr往兩邊擴(kuò)增，并不能擴(kuò)增出線性rna的任何片段。但是對(duì)于環(huán)狀rna來(lái)說(shuō)，此類(lèi)背靠背引物相對(duì)來(lái)說(shuō)，就是面對(duì)面的引物了，故而可以擴(kuò)增出來(lái)上下游引物之間的cdna片段，即可以擴(kuò)增出首尾相接的那段序列?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，背靠背引物是只能擴(kuò)增環(huán)狀rna而不會(huì)擴(kuò)增線性rna的引物。故我們要設(shè)計(jì)的方法就是如何有效快捷地設(shè)計(jì)環(huán)狀rna的背靠背引物。

2、本發(fā)明環(huán)狀rna引物設(shè)計(jì)方案：

(1)以hsa_circ_0001727這個(gè)環(huán)狀rna為例，在circbase找出環(huán)狀rna的dna序列(由circbase數(shù)據(jù)庫(kù)可知該環(huán)狀rna的dna序列含889個(gè)堿基)，序列如下(seqidno:1)：

(2)將兩條相同的上述序列，3’和5’連接在一起，變成新的一條序列，如下所示(seqidno:2)：

gaatagtaaagaaacacatcataaaacctcccaggacataaaggtgagcacagaccctgtttggatcaagtcagttcctggagcctgaatgatgactgctgaatcacgggaagccacgggtctgtccccacaggctgcacaggagaaggatggtatcgtaatagtgaaggtggaagaggaagatgaggaagaccacatgtgggggcaggattccaccctacaggacacgcctcctccagacccagagatattccgccaacgcttcaggcgcttctgttaccagaacacttttgggccccgagaggctctcagtcggctgaaggaactttgtcatcagtggctgcggccagaaataaacaccaaggaacagatcctggagcttctggtgctagagcagtttctttccatcctgcccaaggagctccaggtctggctgcaggaataccgccccgatagtggagaggaggccgtgacccttctagaagacttggagcttgatttatcaggacaacaggtaaaaagaggtgaaacctattatgtgtgagcagggcacagacgttgaaactggagccaggagaagtattggcaggctttaggttattaggtggttactctgtcttaaaaatgttctggctttcttcctgcatccactggcatactcatggtctgtttttaaatattttaattcccatttacaaagtgatttacccacaagcccaacctgtctgtcttcaggtcccaggtcaagttcatggacctgagatgctcgcaagggggatggtgcctctggatccagttcaggagtcctcgagctttgaccttcatcacgaggccacccagtcccacttcaaacattcgtctcggaaaccccgcctcttacagtcacgaggaatagtaaagaaacacatcataaaacctcccaggacataaaggtgagcacagaccctgtttggatcaagtcagttcctggagcctgaatgatgactgctgaatcacgggaagccacgggtctgtccccacaggctgcacaggagaaggatggtatcgtaatagtgaaggtggaagaggaagatgaggaagaccacatgtgggggcaggattccaccctacaggacacgcctcctccagacccagagatattccgccaacgcttcaggcgcttctgttaccagaacacttttgggccccgagaggctctcagtcggctgaaggaactttgtcatcagtggctgcggccagaaataaacaccaaggaacagatcctggagcttctggtgctagagcagtttctttccatcctgcccaaggagctccaggtctggctgcaggaataccgccccgatagtggagaggaggccgtgacccttctagaagacttggagcttgatttatcaggacaacaggtaaaaagaggtgaaacctattatgtgtgagcagggcacagacgttgaaactggagccaggagaagtattggcaggctttaggttattaggtggttactctgtcttaaaaatgttctggctttcttcctgcatccactggcatactcatggtctgtttttaaatattttaattcccatttacaaagtgatttacccacaagcccaacctgtctgtcttcaggtcccaggtcaagttcatggacctgagatgctcgcaagggggatggtgcctctggatccagttcaggagtcctcgagctttgaccttcatcacgaggccacccagtcccacttcaaacattcgtctcggaaaccccgcctcttacagtcacgag

(3)用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)引物：把上述的新序列放入primerpremier5軟件，設(shè)置條件為：上游引物位置：589-889(即n-300到n之間)；下游引物位置：889-1189(即n到n+300之間)；引物長(zhǎng)度：18-23bp；擴(kuò)增長(zhǎng)度：70-300bp；gc比例40％-60％；根據(jù)上述條件搜索條件搜索出來(lái)的引物(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為234bp)：

上游引物(5’-3’)：agtcccacttcaaacattc(seqidno:3)；

下游引物(5’-3’)：tcttcctcttccaccttc(seqidno:4)。

(4)引物blast：把上述引物用網(wǎng)頁(yè)blast進(jìn)行搜索，明確該引物不能擴(kuò)增出線性rna分子及其他rna分子，則該引物為我們最終設(shè)計(jì)的引物。

(5)驗(yàn)證設(shè)計(jì)的引物能擴(kuò)增環(huán)狀rna而不是線性rna：

rnaser是一種只能消化線性rna而不能消化環(huán)狀rna的試劑。因此該法設(shè)計(jì)的引物只要能檢測(cè)出環(huán)狀rna能不被rnaser消化這個(gè)事實(shí)，而且擴(kuò)增出來(lái)?xiàng)l帶大小與預(yù)期一致，則說(shuō)明該引物確實(shí)是能擴(kuò)增出環(huán)狀rna

實(shí)驗(yàn)方法：zkscan1的擴(kuò)增引物：上游引物為aatctcagtagggacaacagg(seqidno:5)，下游引物為gcatgacaactccgaaca(seqidno:6)，擴(kuò)增條帶大小為134bp，取rna總量為20ug的樣品(其中包括zkscan1(線性rna)和hsa_circ_0001727(環(huán)狀rna))，平均分成兩份(即每份有10ugrna)，兩份rna均用depc水補(bǔ)充體積到17ul，再用2ul10×rnaser反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充至19ul。此后一份rna樣本用1ul水補(bǔ)充作為陰性對(duì)照組，另外一份樣本用1ul20×rnaser溶液(廣州吉賽生物有限公司購(gòu)買(mǎi))作為實(shí)驗(yàn)組，在37℃水浴鍋加熱15分鐘，85℃加熱5分鐘。用上述兩份處理后的標(biāo)本做qrt-pcr實(shí)驗(yàn)，利用-△△t法算出實(shí)驗(yàn)組的特定的線性rna及環(huán)狀rna的量較陰性對(duì)照組是否有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，圖6中左邊的柱狀圖是分別以陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組為模板采用zkscan1(線性rna)的引物(seqidno:5和seqidno:6)擴(kuò)增的結(jié)果，從rna表達(dá)量變化可以看出，線性rna被rnaser基本消化完全，圖6中右邊的柱狀圖是分別以陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組為模板采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物(seqidno:3和seqidno:4)擴(kuò)增的結(jié)果，從rna表達(dá)量變化可以看出，本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物能夠擴(kuò)增環(huán)狀rnahsa_circ_0001727并且只能擴(kuò)增環(huán)狀rnahsa_circ_0001727，不能擴(kuò)增線性rna，因?yàn)槿绻景l(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物能夠擴(kuò)增線性rna的話，以陰性對(duì)照組為模板采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物(seqidno:3和seqidno:4)擴(kuò)增的rna表達(dá)量會(huì)大大高出實(shí)驗(yàn)組為模板采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna引物(seqidno:3和seqidno:4)擴(kuò)增的rna表達(dá)量(由于實(shí)驗(yàn)組的gapdh會(huì)被消化，所以對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均選用對(duì)照組的gadph表達(dá)量作為內(nèi)參)。

實(shí)驗(yàn)方法：陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組如上圖試驗(yàn)方法。用兩份標(biāo)本做逆轉(zhuǎn)錄，分別采用線性rna的引物(seqidno:5和seqidno:6)和本發(fā)明設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna的引物(seqidno:3和seqidno:4)并以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板做普通pcr(擴(kuò)增方法根據(jù)不同公司的qpcr試劑盒而定)，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后取出擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖7所示，觀察結(jié)果：1、擴(kuò)增條帶的位置是否與設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)期大小一致，如圖7中右邊兩個(gè)泳道，has_circ_0001727的引物擴(kuò)增約234bp，條帶大小相符，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)可行；2、條帶亮度：如圖7中左邊兩個(gè)泳道，線性rna對(duì)應(yīng)的條帶，用rnaser處理后亮度會(huì)較弱，而環(huán)狀rna則亮度不變，說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物確實(shí)是能擴(kuò)增出環(huán)狀rna，并且不能擴(kuò)增線性rna。

3、本發(fā)明方法流程圖如圖5所示。

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

序列表

<110>龔暢、宋爾衛(wèi)、梁格豪

<120>一種環(huán)狀rna引物的設(shè)計(jì)方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2139

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<400>1

tggaaggaggcaaaaccggaagaccttatggattcaaaacttagatgtgtgtttgaattg60

ccagcagagaatgataaaccagtaagtatatttatagttaacaataattgaatgttgtaa120

gctgatacttatttgcataccatttcctgcaaaaccaagatttaagttggcaaattattt180

tcctttatctgatgtctgaagaaaaaaaataagctgaagtcagcaaataagtgggccttt240

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tcacttgtgaccagttgaagaaaggagactgtatctgaaatgctaatttggacttccctt900

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caagcctcctaaccccactaaggcaatcctagggatgttcacatctttgtggtgacagta1620

atttgtggctaataattcctgagcttgcacaattacagtatgctgatttttccgtggcag1680

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tcttctttggatgacaccgaagttaagaaggttatggaagaatgtaagaggctgcaaggt2100

gaagttcagaggctacgggaggagaacaagcagttcaag2139

<210>2

<211>4278

<212>dna

<213>人工序列

<400>2