專利名稱：多個基因組的同時分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及使用高密度結(jié)果輸出平臺例如微陣列進行遺傳分析的方法，更具體來說，涉及多重基于雜交分析的方法，以便從不同的分析獲得的結(jié)果可以在單一結(jié)果輸出平臺上進行分析。
背景技術(shù)：
基因組材料是復(fù)雜的，因此在混合物中每種序列以相對低的濃度存在。其結(jié)果是，在給定的探針濃度下，探針序列將與基因組模板以有限的速度進行雜交。探針的濃度可以在一定程度上進行調(diào)整以改變該速度，但是當探針的復(fù)雜程度增加時，例如當使用高度多重分析時，這種靈活性被極大地降低了。相反，識別雜交結(jié)構(gòu)的酶通常具有強的結(jié)合親和性，因此可以被用來在短得多的時間內(nèi)(數(shù)秒到數(shù)分鐘)將探針-基因組復(fù)合物加工成擴增的模板。
有幾種基于雜交的分析方法可用于分析DNA，所述分析包含了將探針與基因組模板進行雜交的雜交步驟和模板驅(qū)動反應(yīng)產(chǎn)生模板擴增的酶處理步驟，所述模板可以使用標準的方法例如Syvanen，NatureGenetics Supplement，37S5-S10(2005)中的方法來進行擴增。從這樣的擴增模板產(chǎn)生的擴增子然后可以通過將標記的探針上的序列與固相支持物例如微陣列上它們相應(yīng)的互補序列進行雜交來平行地讀出。
由于含有數(shù)百萬功能部件的微陣列可以被有效地生產(chǎn)，并且因為對復(fù)雜的遺傳過程的研究通常需要分析來自許多不同基因組的樣品，因此在上面的方法中，如果在分開的反應(yīng)中部分處理的不同基因組可以被合并，并在單一的微陣列上讀出，這將是有利的。因為在許多研究中對于任何一個樣品來說不需要完全使用整個微陣列，這種方法將降低花費，并增加該方法的通量。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了對多個基于雜交的分析進行多路結(jié)果輸出的方法，這些分析每個都包含了一個或多個雜交或退火步驟以及一個或多個酶法處理步驟。具體來說，本發(fā)明通過執(zhí)行下面的步驟提供了同時分析多個基因組以獲得每個基因組上一個或多個位點的序列信息的方法(a)為每個基因組提供一組探針，該組中的每個探針對于基因組中的一個位點來說是特異的；(b)將每組探針分別與其相應(yīng)的基因組進行雜交，以在分開的反應(yīng)混合物中形成探針-基因組復(fù)合物；(c)將分開的反應(yīng)混合物合并并且對探針-基因組復(fù)合物進行酶法處理以形成可擴增的探針；(d)擴增并標記可擴增的探針以形成標記的探針，以便對于每個不同基因組的每個不同位點來說都存在獨一無二的標記探針；以及(e)將標記的探針與微陣列上它們相應(yīng)的互補序列進行特異性雜交，以便與微陣列特異性雜交的標記的探針的存在與否可以指示多個基因組中每個基因組的一個或多個位點中的每個位點的序列信息。在一種情況下，每個探針含有寡核苷酸標簽。
本發(fā)明可用于多重基于雜交的分析的應(yīng)用，以檢測從許多不同個體獲得的基因組樣品的特征。通過對不同個體的樣品分別進行雜交步驟，然后將它們合并進行酶法處理，人們可以利用雜交反應(yīng)和酶反應(yīng)天然的反應(yīng)速度差異以確保在單一結(jié)果輸出平臺例如微陣列、微珠組等上多個分析的產(chǎn)物分析。
附圖簡述

圖1A-1B圖解說明了本發(fā)明的一個實施方案的操作。
圖1C-1E說明了不同基因組的不同位點的信息可以被寡核苷酸標簽和熒光標記物編碼的不同方式。
圖2A-2B概略描述了使用多組分子倒置探針對不同的基因組進行基因分型，其中使用了依照本發(fā)明的單一的結(jié)果輸出裝置。
定義本文中使用的核酸化學、生物化學、遺傳學和分子生物學術(shù)語和符號遵從本領(lǐng)域的標準專題論文和教科書中的定義，例如Kornberg和Baker，DNA Replication，Second Edition(W.H.Freeman，New York，1992)；Lehninger，Biochemistry，Second Edition(Worth Publishers，NewYork，1975)；Strachan和Read的，Human Molecular Genetics，SecondEdition(Wiley-Liss，New York，1999)；Eckstein主編的寡核苷酸Oligonucleotides and AnalogsA Practical Approach(Oxford UniversityPress，New York，1991)；Gait主編的寡核苷酸Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1984)等。
“可尋址的”或“尋址”對于標簽互補序列來說，是指標簽互補序列可以根據(jù)它的地址確定的核苷酸序列或可能其它的物理或化學特性，即在標簽互補序列的序列或其它性質(zhì)與它結(jié)合在固相支持物上的空間位置或固相支持物的性質(zhì)之間存在一一對映的關(guān)系。優(yōu)選情況下，標簽互補序列的地址是空間位置，例如含有標簽互補序列的拷貝的特定區(qū)域的平面坐標。在其它的實施方案中，探針可以以其它的方式被尋址，例如通過微粒的大小、形狀、顏色、顏色或熒光比率、微型發(fā)射應(yīng)答器的無線電頻率等，例如Kettman等，Cytometry，33234-243(1998)；Xu等，Nucleic Acids Research，31e43(2003)；Bruchez，Jr.等，美國專利6,500,622；Mandecki，美國專利6,376,187；Stuelpnagel等，美國專利6,396,995；Chee等，美國專利6,544,732；Chandler等，PCT公開WO 97/14028等。
“擴增子”是指多聚核苷酸擴增反應(yīng)的產(chǎn)物。也就是說，它是多聚核苷酸的群體，通常為雙鏈，從一個或多個起始序列復(fù)制而來。該一個或多個起始序列可以是同樣序列的一個或多個拷貝，也可以是不同序列的混合物。擴增子可以通過多種擴增方法產(chǎn)生，這些擴增方法的產(chǎn)物是一個或多個靶核酸多次復(fù)制的結(jié)果。一般來說，產(chǎn)生擴增子的擴增反應(yīng)是“模板驅(qū)動的”，其中反應(yīng)試劑(或為核苷酸或為寡核苷酸)的堿基配對，在創(chuàng)建反應(yīng)產(chǎn)物所需的模板多核苷酸中具有互補序列。一方面，模板驅(qū)動的反應(yīng)是使用核酸聚合酶的引物延伸或使用核酸連接酶的寡核苷酸連接。這樣的反應(yīng)包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCRs)、線性聚合酶反應(yīng)、基于核酸序列的擴增(NASBAs)、滾環(huán)擴增等，它們在下面的參考文獻中被公開，在此引為參考Mullis等，美國專利4,683,195、4,965,188、4,683,202、4,800,159(PCRs)；Gelfand等，美國專利5,210,015(使用“Taqman”探針的實時PCR)；Wittwer等，美國專利6,174,670；Kacian等，美國專利5,399,491(″NASBA″)；Lizardi，美國專利5,854,033；Aono等，日本專利公開JP4-262799(滾環(huán)擴增)等。在一種情況下，本發(fā)明的擴增子通過PCRs產(chǎn)生。如果允許在擴增反應(yīng)進程中測量反應(yīng)產(chǎn)物的檢測化學方法可用，擴增反應(yīng)可以是“實時”的擴增，例如下面描述的“實時PCR”，或在Leone等在NucleicAcids Research，262150-2155(1998)中描述的“實時NASBA”，以及類似文獻。本文中使用的術(shù)語“擴增”是指執(zhí)行擴增反應(yīng)?！胺磻?yīng)混合物”是指含有執(zhí)行反應(yīng)的所有必需反應(yīng)試劑的溶液，其中可以包括但不限于緩沖試劑(在反應(yīng)過程中將pH維持在選定水平)、鹽、輔助因子、凈化劑等。
“互補或基本上互補”是指核苷酸或核酸之間、例如在雙鏈DNA分子的兩條鏈之間或寡核苷酸引物和單鏈核酸的引物結(jié)合位點之間的雜交或堿基配對或雙鏈體的形成。互補的核苷酸一般是A和T(或A和U)，或C和G。兩個單鏈的RNA或DNA分子，當其中一條鏈的核苷酸經(jīng)過最適排列和比較，并進行適當?shù)暮塑账岵迦牒蛣h除后，與另一條鏈的至少大約80％的核苷酸配對、通常至少大約90％到95％、更優(yōu)選大約98％到100％的核苷酸配對時，這兩條鏈被說成是基本上互補的。此外，當RNA或DNA鏈在選擇性的雜交條件下與其互補序列雜交時，它們存在基本上的互補性。一般來說，當在跨度至少14到25個核苷酸的范圍內(nèi)存在至少大約65％、優(yōu)選至少大約75％、更優(yōu)選大約90％的互補性時，選擇性的雜交將會發(fā)生。參見M.Kanehisa，NucleicAcids Res.12203(1984)，在此引為參考。
“復(fù)合物”是指分子彼此之間通過直接或間接的接觸形成的集合體或積聚體。在一種情況下，對于分子復(fù)合物來說、或?qū)τ谔禺愋曰蛱禺惤Y(jié)合來說，“接觸”或更具體的“直接接觸”是指兩個或多個分子足夠接近，以至于吸引性的非共價相互作用、例如范德華力、氫鍵、離子和疏水相互作用等成為分子間的主要相互作用。在這樣的情況下，分子復(fù)合物是穩(wěn)定的，因為在分析條件下復(fù)合物與其組成分子的非積聚或非復(fù)合狀態(tài)相比在熱力學上更加有利。本文中使用的“復(fù)合物”是指多聚核苷酸的雙鏈體或三鏈體，或兩個或多個蛋白的穩(wěn)定的集合體。對于后者，復(fù)合物是通過抗體與其相應(yīng)抗原的特異性結(jié)合來形成的。
“雙鏈體”是指至少兩個完全或部分互補的寡核苷酸和/或多聚核苷酸在所有或大多數(shù)它們的核苷酸中進行了Watson-Crick類型的堿基配對，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物。術(shù)語“退火”和“雜交”可以互換使用，是指穩(wěn)定的雙鏈體的形成。在一種情況下，穩(wěn)定的雙鏈體是指雙鏈體的結(jié)構(gòu)不被嚴格的清洗條件所破壞，該條件包括例如比雙鏈體的一條鏈的Tm低大約5℃的溫度和低的單價鹽濃度，例如低于0.2M，或低于0.1M?！巴昝榔ヅ洹睂τ陔p鏈體來說是指組成雙鏈體的多聚或寡核苷酸鏈彼此之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，以至于一條鏈上的每個核苷酸都與另一條鏈中的核苷酸進行了Watson-Crick堿基配對。術(shù)語“雙鏈體”包含了可以使用的核苷類似物的配對，例如脫氧肌苷、帶有2-氨基嘌呤堿基的核苷、PNAs等。雙鏈體中在兩個寡核苷酸或多聚核苷酸之間的“誤配”是指雙鏈體中的一對核苷酸不能進行Watson-Crick結(jié)合。
對于基因組或靶多聚核苷酸來說，“遺傳位點”或“位點”是指基因組或靶多聚核苷酸的毗連的亞區(qū)或區(qū)段。使用在本文中時，遺傳位點或位點可以是指核苷酸、基因或基因的一部分在基因組中、包括線粒體DNA中的位置，它也可以是指基因組序列中的任何毗連的部分，不論它是否位于基因內(nèi)部或與基因相關(guān)。在一種情況下，遺傳位點是指基因組序列、包括線粒體DNA中的任何部分，長度從單個核苷酸到幾百個核苷酸、例如100-300個核苷酸長度的片段。通常，特定的遺傳位點可以通過其核苷酸序列或一個或兩個臨近或兩側(cè)區(qū)域的核苷酸序列來鑒別。
“雜交”是指兩個單鏈多聚核苷酸非共價地結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈多聚核苷酸的過程。術(shù)語“雜交”也可以是指三鏈的雜交。產(chǎn)生的雙鏈多聚核苷酸(通常情況下)是“雜交體”或“雙鏈體”?！半s交條件”一般包括低于大約1M的鹽濃度，更通常低于大約500mM和低于大約200mM。雜交溫度可以低至5℃，但是一般來說高于22℃，更典型高于大約30℃，優(yōu)選超過約37℃。雜交通常在嚴格的條件下進行，即在該條件下探針將與其靶子序列雜交。嚴格的條件是序列依賴性的，在不同情況下有所不同。較長的片段可能需要較高的雜交溫度以便特異性雜交。因為其它的因素可能影響雜交的嚴格性，包括互補鏈的堿基組成和長度、有機溶劑的存在和堿基誤配的程度，因此這些參數(shù)的組合比任何一個單獨的參數(shù)的絕對數(shù)值更加重要。一般來說，嚴格的條件被選擇為在確定的離子強度和pH下比具體的序列的Tm低5℃。示例的嚴格條件包括在pH7.0到8.3和溫度至少為25℃的條件下，鹽濃度為至少0.01M到不超過1M Na離子濃度(或其它鹽)，。例如，5xSSPE(750mM NaCl，50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃溫度的條件適合于等位基因特異性的探針雜交。對于嚴格條件來說，可以參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsche和Maniatis的“MolecularCloning ALaboratory Manual”2ndEd.Cold Spring Harbor Press(1989)和Anderson的“Nucleic Acid Hybridization”1stEd.，BIOS Scientific Publishers Press(1999)，出于上面的所有目的以其全文引為參考。“特異地雜交”或“特異性雜交”或類似的表述是指分子在嚴格條件下基本上或只與特定核苷酸序列(當所述序列存在于復(fù)雜的混合物(例如全細胞)DNA或RNA中時)結(jié)合、成雙鏈、或雜交。
“基于雜交的分析”是指任何依賴穩(wěn)定復(fù)合物的形成作為特異性結(jié)合事件結(jié)果的分析。在一種情況下，基于雜交的測試分析是指任何依賴探針和靶核苷酸序列之間的穩(wěn)定的雙鏈體或三鏈體的形成以檢測或測定該序列的分析。在一種情況下，該分析的探針與靶序列的8到100個核苷酸范圍內(nèi)的區(qū)域退火(或與其形成雙鏈體)；在其它情況下，它們與靶序列的8到40個核苷酸范圍內(nèi)的區(qū)域退火，或者更通常情況下，與靶序列的8到20個核苷酸。對于基于雜交的分析來說，“探針”是指其序列能夠與靶核酸上的互補序列形成穩(wěn)定的雜交體(或三鏈體)、并且能夠被直接或間接檢測的多聚核苷酸。基于雜交的分析包括但不限于使用一個或多個寡核苷酸的特異性堿基配對作為靶識別元件的分析，例如聚合酶鏈反應(yīng)、NASBA反應(yīng)、寡核苷酸連接反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)、可環(huán)化的探針反應(yīng)、等位基因特異性的寡核苷酸雜交，它們既可以存在于溶液相中，也可以結(jié)合到固相支持物上、例如微陣列或微珠等。一個重要的基于雜交的分析亞組包括那些在雜交步驟之后具有至少一個酶法處理步驟的分析。這種亞組的基于雜交的分析包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)、NASBA反應(yīng)、寡核苷酸連接反應(yīng)、例如在Invader分析中的切割酶反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)、探針環(huán)化反應(yīng)等。關(guān)于基于雜交的分析文獻中有廣泛的指導(dǎo)，例如Hames等主編的NucleicAcid Hybridization a Practical Approach(IRL Press，Oxford，1985)，Tijssen的Hybridization with Nucleic Acid Probes的Part I & II(ElsevierPublishing Company，1993)，Hardiman的Microarray Methods andApplications(DNA Press，2003)，Schena主編的DNA Microarrays aPractical Approach(IRL Press，Oxford，1999)等。在一種情況下，基于雜交的分析是溶液相分析；也就是說，探針和靶序列二者均在對反應(yīng)速度基本上沒有表面效應(yīng)或影響的條件下進行雜交。溶液相分析包括探針或靶序列被結(jié)合到微珠上，以至于被結(jié)合的序列與游離的序列具有基本上相同的環(huán)境(例如允許試劑接近等)的情況。在另一種情況下，基于雜交的分析包括免疫分析，其中抗體利用了基于擴增的核酸報告物。在這種分析中，抗體探針在分開的反應(yīng)中與靶分子例如蛋白特異性結(jié)合，之后所述反應(yīng)的產(chǎn)物(即抗體-蛋白復(fù)合物)被合并，核酸報告物被擴增。在優(yōu)選情況下，所述核酸報告物包括下面描述的被酶法轉(zhuǎn)化為標記的寡核苷酸標簽以用于微陣列上的分析的寡核苷酸標簽。下面的示例性的參考文獻公開了用于免疫分析的抗體-核酸偶聯(lián)物，在此引為參考Baez等的美國專利No.6,511,809，Sano等的美國專利No.5,665,539，Eberwine等的美國專利No.5,922,553，Landegren等的美國專利No.6,558,928，Landegren等的美國專利申請2002/0064779等。具體來說，最后兩個Landegren等的專利申請公開了在特異性結(jié)合事件后形成可擴增的探針的步驟。
“試劑盒”是指任何用于遞送執(zhí)行本發(fā)明的方法的材料或試劑的遞送系統(tǒng)。對于分析來說，這樣的遞送系統(tǒng)包括允許將反應(yīng)試劑(例如在適當?shù)娜萜髦械奶结槨⒚傅?和/或支持材料(例如執(zhí)行分析等的緩沖液、文字說明等)從一個地方到另一個地方的儲存、運輸或遞送的系統(tǒng)。例如，試劑盒含有一個或多個內(nèi)容物(例如盒子)，含有用于本發(fā)明的分析的相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料。在一種情況下，本發(fā)明的試劑盒含有特異性干擾多態(tài)性位點的探針。在另一種情況下，試劑盒含有核酸標準品，用于校準特異性干擾多態(tài)性位點的探針的執(zhí)行情況。這樣的內(nèi)含物可以一起或分別遞送給目標接受者。例如，第一個容器可以含有在分析中使用的酶，而第二個容器含有探針。
“連接”是指在兩個或多個核酸、例如寡核苷酸和/或多聚核苷酸的末端之間在模板驅(qū)動的反應(yīng)中形成共價鍵或連接。鍵或連接的本質(zhì)可以廣泛地變化，連接可以通過酶法或化學法來進行。在本文中使用時，連接通常通過酶法進行，以在一個寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳和另一個寡核苷酸的3’碳之間形成磷酸二酯連接。下列參考文獻中描述了多種模板驅(qū)動的連接反應(yīng)，在此引為參考Whitely等的美國專利No.4,883,750，Letsinger等的美國專利No.5,476,930；Fung等的美國專利No.5,593,826；Kool的美國專利No.5,426,180；Landegren等的美國專利No.5,871,921；Xu和Kool，Nucleic Acids Research，27875-881(1999)；Higgins等，Methods in Enzymology，6850-71(1979)；Engler等，The Enzymes，153-29(1982)以及Namsaraev的美國專利公開2004/0110213。
“微陣列”是指一類復(fù)合的分析產(chǎn)品，其含有具有基本上是平面表面的固相支持物，其上排列有空間位置確定的不重疊的區(qū)域或位點，每個區(qū)域或位點含有被固定的雜交探針?！盎旧鲜瞧矫娴摹笔侵副砻嫔细信d趣的區(qū)塊或目標例如探針位點，可以占據(jù)一個延伸至表面的上部或下部的體積，其尺度相對于表面的尺度來說較小。例如，排列在光導(dǎo)纖維束表面的珠子產(chǎn)生了基本上是平面的探針位點表面，或排列或合成在多孔性平面底物上的寡核苷酸產(chǎn)生了基本上是平面的表面?？臻g位置確定的位點也可以是“可尋址的”，因為其位置和在該位置固定的探針的身份是已知的或可確定的。固定在微陣列上的探針包括產(chǎn)生于測試分析反應(yīng)的核酸，例如寡核苷酸條型碼。一般來說，微陣列上的寡核苷酸或多聚核苷酸是單鏈的，通常通過5’末端或3’末端被共價連接到固相支持物上。微陣列中含有核酸的不重疊區(qū)域的密度一般大于100個/厘米2，更優(yōu)選情況下大于1000個/厘米2。與核酸探針相關(guān)的微陣列技術(shù)在下面例舉的參考文獻中有綜述Schena主編MicroassaysA Practical Approach(IRL Press，Oxford，2000)；Southern，Current Opin.Chem.Biol.，2404-410(1998)；Nature GeneticsSupplement，211-60(1999)以及Fodor等的美國專利Nos.5,424,186、5,445,934和5,744,305。微陣列可以含有微珠或其它微粒的陣列，排列在平的表面上。這樣的微陣列可以通過多種方式形成，如同在下面例舉的參考文獻中公開的那樣Brenner等，Nature Biotechnology，18630-634(2000)；Tulley等的美國專利No.6,133,043；Stuelpnagel等的美國專利No.6,396,995；Chee等的美國專利No.6,544,732；等等。在一種形式中，微陣列是通過將連接有寡核苷酸的微珠隨機排列在表面上、然后通過一個解碼步驟確定哪個微珠帶有哪個寡核苷酸來形成的，例如在Gunderson等的美國專利公開序列號No.2003/0096239中公開的那樣。
本文中使用的“核苷”包括天然的核苷，包括2’-脫氧和2’-羥基形式的核苷，例如在Komberg和Baker的DNA Replication，2ndEd.(Freeman，San Francisco，1992)中描述的那些?！邦愃莆铩笔侵负塑眨ň哂行揎椀膲A基和/或修飾的糖基的合成核苷，例如Scheit的Nucleotide Analogs(John Wiley，New York，1980)、Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，90543-584(1990)等中的描述，但條件是它們能夠特異性雜交。這樣的類似物包括被設(shè)計用來增強結(jié)合性質(zhì)、減小復(fù)雜性、增加特異性等的合成核苷。包含了具有增強的雜交或核酸酶抗性性質(zhì)的類似物的多聚核苷酸被描述在Uhlman和Peyman(同前面的引證)、Crooke等，Exp.Opin.Ther.Patents，6855-870(1996)、Mesmaeker等，Current Opinion in Structual Biology，5343-355(1995)等中。能夠增強雙鏈體穩(wěn)定性的多聚核苷酸類型的例子包括N3’→P5’氨基磷酸酯寡核苷酸(本文中稱為“酰胺化物”)、肽核酸(本文中稱為“PNAs”)、寡聚-2’-O-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多聚核苷酸、鎖核酸(LNAs)等類似化合物。這樣的寡核苷酸可以商業(yè)獲得，也可以使用文獻中描述的方法來合成。
“寡核苷酸”或“多聚核苷酸”可以同義使用，是指天然的或修飾的核苷單體通過磷酸二酯鍵或其類似物連接成的線性聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”通常指較短的聚合物，例如含有從大約3個到大約100個單體，術(shù)語“多聚核苷酸”通常指較長的聚合物，例如含有從大約100個單體到很多千個單體，例如10000個單體或以上。包含探針或引物的寡核苷酸通常的長度范圍從12到60個核苷酸，更通常從18到40個核苷酸。寡核苷酸和多聚核苷酸可以是天然或合成的。寡核苷酸和多聚核苷酸包括脫氧核糖核苷、核糖核苷及其非天然的類似物，例如它們的端基異構(gòu)形式、肽核酸(PNAs)等，只要它們能夠通過規(guī)則單體-單體相互作用模式與靶基因組特異性結(jié)合，例如Watson-Crick類型的堿基配對、堿基堆積、Hoogsteen或反Hoogsteen類型的堿基配對等。一般來說，核苷單體通過磷酸二酯鍵連接。只要核苷酸由一系列字母例如″ATGCCTG″表示時，應(yīng)該被理解為核苷酸從左到右是按照5’→3’次序的，除非特別注明，其中“A”表示脫氧腺苷，“C”代表脫氧胞苷，“G”代表脫氧鳥苷，“T”代表脫氧胸苷，“U”代表核糖核苷，尿苷。一般來說，寡核苷酸含有四種天然的脫氧核糖核苷酸，但是，它們也可以含有核糖核苷或非天然的核苷酸類似物。對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說，何時可以在本文描述的方法或過程中使用含有天然的或非天然的核苷的寡核苷酸是非常清楚的。例如，當需要用酶處理時，通常需要僅由天然核苷酸構(gòu)成的寡核苷酸。同樣，當酶的活力需要特定的寡核苷酸或多聚核苷酸底物、例如單鏈DNA、RNA/DNA雙鏈體等時，選擇適當?shù)墓押塑账峄蚨嗑酆塑账岬孜锝M成完全在本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)寡核苷酸，特別是在專著論文的指導(dǎo)下，例如Sambrook等的Molecular Cloning，Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)，及類似參考書。寡核苷酸和多聚核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。
“寡核苷酸標簽”是指與多聚核苷酸結(jié)合、并被用來在反應(yīng)中鑒定和/或追蹤多聚核苷酸的寡核苷酸。一般來說，寡核苷酸標簽被結(jié)合到多聚核苷酸的3’-或5’-末端以形成線性的偶聯(lián)物，在本文中有時被稱為“加標簽的多聚核苷酸”或等價的“寡核苷酸標簽-多聚核苷酸偶聯(lián)物”、或“標簽-多聚核苷酸偶聯(lián)物”。寡核苷酸標簽的大小和組成可以廣泛地變化，下面的參考文獻為選擇適合于具體實施方案的寡核苷酸標簽組提供了指導(dǎo)Brenner的美國專利No.5,635,400；Brenner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，971665-1670(2000)；Shoemaker等，NatureGenetics，14450-456(1996)；Morris等的歐洲專利申請0799897A1；Wallace的美國專利No.5,981,179等。在本發(fā)明的不同應(yīng)用中，寡核苷酸標簽的長度每個可以分別在4到36個核苷酸、或6到30個核苷酸、或8到20個核苷酸的范圍內(nèi)。在一種情況下，寡核苷酸標簽成組或按所有組成成分使用，其中組中的每個寡核苷酸標簽具有獨一無二的核苷酸序列。在某些實施方案中，特別是當寡核苷酸標簽被用于分類多聚核苷酸時，或當它們通過特異性雜交被鑒定時，該組中的每個寡核苷酸標簽的熔點溫度與該組中每個其它的成員的熔點溫度基本上相同。在這種情況下，組中的寡核苷酸標簽的熔點溫度彼此之間在10℃的范圍內(nèi)；在另一個實施方案中，它們彼此之間在5℃的范圍內(nèi)；在另一個實施方案中，它們彼此之間在2℃的范圍內(nèi)。另一方面，寡核苷酸標簽是交叉雜交最少的組的成員。也就是說，該組中每個成員的核苷酸序列與該組中每個其它成員的序列之間有足夠的不同，以至于在嚴格的條件下，沒有成員能夠與任何其它成員的互補序列形成穩(wěn)定的雙鏈體。在一種情況下，交叉雜交最少的組的每個成員的核苷酸序列與每個其它成員的序列至少有兩個核苷酸的區(qū)別。這樣的寡核苷酸標簽組的大小在幾十到很多千甚至幾百萬的范圍內(nèi)，例如從50個到1.6×106。在另一個實施方案中，這種大小在200到40,000的范圍內(nèi)，或從200到40,000個、或從200到10,000個的范圍內(nèi)。
“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”是指通過DNA互補鏈的同時引物延伸在體外擴增特異的DNA序列的反應(yīng)。換句話說，PCR是用于制造兩側(cè)具有引物結(jié)合位點的靶核酸的多個拷貝或復(fù)制本的反應(yīng)，這種反應(yīng)含有下列步驟的一個或多個重復(fù)(i)將靶核酸變性，(ii)將引物與引物結(jié)合位點退火，以及(iii)在存在核苷三磷酸的情況下通過核酸聚合酶延伸引物。一般來說，反應(yīng)在熱循環(huán)儀器中按照為每一步最適化的不同溫度循環(huán)進行。具體溫度、各步驟的時限和步驟間的變化速度依賴于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的許多因素，例如在下列參考文獻中例舉的McPherson等主編的PCRA Practical Approach和PCR2APractical Approach((IRL Press，Oxford，分別在1991年和1995年出版)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常規(guī)PCR中，雙鏈靶核酸可以在＞90℃的溫度下變性，引物退火在50-75℃的溫度范圍內(nèi)進行，引物延伸在72-78℃的溫度范圍內(nèi)進行。術(shù)語“PCR”包含了該反應(yīng)的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、實時PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR等。反應(yīng)的體積從幾百納升例如200nL到幾百微升例如200L?！胺崔D(zhuǎn)錄PCR”或“RT-PCR”是指之前通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將靶RNA轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa的單鏈DNA、然后進行擴增的PCR，例如Tecott等的美國專利No.5,168,038，該專利在此引為參考?！皩崟rPCR”是指其中反應(yīng)產(chǎn)物即擴增子的量在反應(yīng)進程中被監(jiān)測的PCR。有許多形式的實時PCR，其主要差別在于用于監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物的檢測化學方法，例如Gelfand等的美國專利5,210,015(″taqman″)，Wittwer等的美國專利6,174,670和6,569,627(插入染料)，Tyagi等的美國專利No.5,925,517(分子信標)，這些專利在此引為參考。實時PCR的檢測化學方法在Mackay等，Nucleic Acids Research，301292-1305(2002)中有綜述，在此也引為參考?！扒短譖CR”是指兩個階段的PCR，其中第一次PCR的擴增子成為使用一套新引物的第二次PCR的樣品，新的引物中至少有一個結(jié)合到第一次的擴增子的內(nèi)部位置上。在本文中使用時，對于嵌套擴增反應(yīng)來說“起始引物”是指用于產(chǎn)生第一個擴增子的引物，“第二引物”是指用于產(chǎn)生第二個、或嵌套擴增子的一個或多個引物。“多重PCR”是指在同樣的反應(yīng)混合物中同時進行多個靶序列(或單個靶序列及一個或多個參比序列)的PCR反應(yīng)，例如Bernard等，Anal.Biochem.，273221-228(1999)(雙色實時PCR)。通常情況下，對于每個被擴增的序列使用不同的引物組。“定量PCR”是指被設(shè)計用來測定樣品或樣本中一個或多個特定的靶序列的豐度的PCR。定量PCR包含了對這些靶序列的絕對定量和相對定量。定量測量可以使用一個或多個參比序列來進行，它們可以被分別測試分析或與靶序列一起進行分析。參比序列對于樣品或樣本來說可以是內(nèi)源的，也可以是外源的，在后一種情況下，可以含有一個或多個競爭子模板。典型的內(nèi)源參比序列包括下列基因的轉(zhuǎn)錄本片段β-肌動蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖體RNA等。定量PCR技術(shù)對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是熟知的，例如在下面的被引為參考的文獻中例舉的Freeman等，Biotechniques，26112-126(1999)；Becker-Andre等，Nucleic Acids Research，179437-9447(1989)；Zimmerman等，Biotechniques，21268-279(1996)；Diviacco等，Gene，1223013-3020(1992)；Becker-Andre等，Nucleic Acids Research，179437-9446(1989)等。
“多態(tài)性”或“遺傳性變型”是指在一個遺傳位點上發(fā)生了一個或多個核苷酸的取代、倒位、插入或缺失，或DNA從一個遺傳位點轉(zhuǎn)位到另一個遺傳位點。在一種情況下，多態(tài)性是指多種可替換的核苷酸序列之一，其可以在個體的遺傳位點中存在，并且其可以在同樣的個體或種群中其它個體中相同的位點上的其它序列上含有核苷酸的取代、插入或缺失。個體在遺傳位點上可以是純合或雜合的；也就是說，個體可以在兩個等位基因上具有相同的核苷酸序列，也可以在每個等位基因上具有不同的核苷酸序列。在一種情況下，遺傳位點的插入和缺失，與種群中的另一個個體的同樣位點(或同樣個體的另一個等位基因)相比，包含了在該位點上增加或缺少了1到10個核苷酸。一般來說，插入或缺失是針對種群中該位點上的主要等位基因來說的，例如在種群中以50％或以上的頻率存在的等位基因。
“引物”是指天然的或合成的寡核苷酸，在與多聚核苷酸模板形成雙鏈體后，它們能夠作為核酸合成的起始點從其3’末端開始沿著模板被延伸，從而形成延長的雙鏈體。在延伸過程中添加的核苷酸的序列由模板多聚核苷酸的序列決定。通常情況下引物通過DNA聚合酶來延伸。引物的長度通常在14到36個核苷酸的范圍內(nèi)。
“結(jié)果輸出值”是指被測量、檢測和/或計算的一個或多個信號產(chǎn)生基團或標記物的特性，可以被轉(zhuǎn)化為數(shù)字或數(shù)值。在一種情況下，分析的結(jié)果輸出值通過使用或應(yīng)用能夠?qū)⒎肿铀缴系姆治鼋Y(jié)果轉(zhuǎn)化為可以被檢測和記錄的信號的儀器和/或方法來獲得。這樣的儀器或方法可以被稱為“結(jié)果輸出裝置”(或儀器)或“結(jié)果輸出程序”(或方法)。結(jié)果輸出值也可以包括、或稱為這種被收集或記錄的數(shù)據(jù)的真實數(shù)字表示。例如，使用微陣列作為結(jié)果輸出裝置的雜交分析的結(jié)果輸出值總的來說是指在微陣列的每個區(qū)塊或雜交位點上產(chǎn)生的引號以及它們的數(shù)字、圖形和/或圖象表示。
“固體支持物”、“支持物”、和“固相支持物”可以互換使用，是指具有剛性或半剛性表面的材料或一組材料。在許多實施方案中，固相支持物的至少一個表面是基本上平的，盡管在某些實施方案中希望將用于不同化合物的合成區(qū)域用例如孔、抬高的區(qū)域、針、蝕刻的凹槽等進行物理上的分隔。根據(jù)其它的實施方案，固相支持物將采用珠子、樹脂、凝膠、微球體或其它幾何構(gòu)型的形式。微陣列通常含有至少一個平的固相支持物，例如玻璃的顯微鏡載玻片。
對于一個分子與另一個分子、例如標記的靶序列與探針的結(jié)合來說，“特異的”或“特異性”是指兩個分子之間的識別、接觸和穩(wěn)定的復(fù)合物的形成，同時該分子與其它分子之間基本上少有識別、接觸或復(fù)合物的形成。在一種情況下，對于第一個分子與第二個分子的結(jié)合來說，“特異的”是指在第一個分子與反應(yīng)或樣品中的其它分子識別和形成復(fù)合物的程度上，它與第二個分子形成最大數(shù)量的復(fù)合物。在優(yōu)選情況下，該最大數(shù)量至少為50％。一般來說，參與特異的結(jié)合事件的分子在其表面上或孔洞中具有能夠引起彼此結(jié)合的分子之間的特異性識別的區(qū)域。特異性結(jié)合的例子包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多聚核苷酸和/或寡核苷酸之間的雙鏈體或三鏈體的形成、受體-配體相互作用等。在本文中使用時，對于特異性或特異性結(jié)合來說，“接觸”是指兩個分子接近到足夠使弱的非共價化學相互作用，例如范德華力、氫鍵、堿基堆積力、離子和疏水相互作用等，成為分子間的主要相互作用。
對于多種熒光標記物來說，“光譜可分辨的”是指標記物的熒光發(fā)射條帶足夠獨特，即充分不重疊，以至于與相應(yīng)標記物結(jié)合的分子標簽可以通過標準的光檢測系統(tǒng)在相應(yīng)的標記物產(chǎn)生的熒光信號的基礎(chǔ)上被鑒別出來，例如使用具有帶通濾波器和光電倍增管的系統(tǒng)等，示例的系統(tǒng)在美國專利Nos.4,230,558、4,811,218等中有描述，或在Wheeless等的Flow CytometryInstrumentation and Data Analysis(Academic Press，New York，1985)的21-76頁中有描述。在一種情況下，光譜可分辨的有機染料例如熒光素、若丹明等，是指波長發(fā)射最大值至少間隔20nm，在另一種情況下，至少間隔40nm。在另一種情況下，對螯合的鑭系元素化合物、量子點等來說，光譜可分辨是指波長發(fā)射最大值至少間隔10nm，在另一種情況下，至少間隔15nm。
“Tm”被用于指“解鏈溫度”(melting temperature)。解鏈溫度是總的雙鏈核酸分子中有一半解離為單鏈時的溫度。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知有幾種等式可用于計算核酸的Tm。正如在標準的參考文獻中指出的那樣，當核酸存在于含有1M NaCl的水性溶液中時，對Tm值的簡單估算可以通過等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)來計算(參見例如Anderson和Young的Nucleic Acid Hybridization中的Quantitative FilterHybridization(1985))。其它的參考文獻(例如Allawi，H.T.和Santa Lucia，J.，Jr.，Biochemistry 36，10581-94(1997))中包含了其它的計算方法，其中為計算Tm值考慮到了結(jié)構(gòu)和環(huán)境以及序列特征的因素。
“樣品”是指一些來自生物、環(huán)境、醫(yī)學或病人來源的材料，需要在其中檢測或測量靶核酸。一方面它意味著包括樣本或培養(yǎng)物(例如微生物培養(yǎng)物)。另一方面，它也意味著包括生物和環(huán)境樣品。樣品可以包括合成來源的樣本。生物樣品可以是動物包括人類、液體、固體(例如糞便)或組織，以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品，以及例如乳制品、蔬菜、肉類和肉類副產(chǎn)品和廢物等的成分。生物樣品可以包括從病人獲取的材料，包括但不限于培養(yǎng)物、血液、唾液、腦脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、針管吸出物等。生物樣品可以從所有各種科的家畜以及未馴化或野生動物獲得，所述動物包括但不限于例如有蹄動物、熊、魚類、嚙齒動物等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料例如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品，以及從食品和乳制品加工儀器、裝置、設(shè)備、器具、一次性和非一次性物品獲得的樣品。這些例子不被解釋為對可用于本發(fā)明的樣品的類型的限制。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了使用單個結(jié)果輸出裝置例如高容量微陣列分析來自多重基于雜交分析的產(chǎn)物的方法，該分析中的每個被定向用于分析不同基因組中的位點。具體來說，本發(fā)明的多重基于雜交的分析包含了雜交或退火步驟，其中分析中的一個或多個寡核苷酸成分與一個或多個靶多聚核苷酸中與它們互補的序列發(fā)生特異性雜交，從而形成識別結(jié)構(gòu)，在本文中被稱為“探針-基因組復(fù)合物”，以及酶法處理步驟，其中一種或多種酶作用于一個或多個它們對應(yīng)的識別結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生可擴增的探針。在一種情況下，多個多重基于雜交的分析的一個或多個雜交步驟彼此分開進行，之后將這些步驟的產(chǎn)物合并以執(zhí)行一個或多個酶法處理步驟。可擴增的探針是核酸結(jié)構(gòu)，例如雙鏈體、環(huán)狀單鏈DNA等，它們能夠整個或部分復(fù)制以產(chǎn)生能夠與微陣列上與其互補的序列發(fā)生特異性雜交的探針。在本發(fā)明中使用的從基于雜交的分析獲得的序列信息包括靶核苷酸例如基因組片段、RNA、cDNA等中特定核酸序列的存在與否或含量。在一種情況下，從基于雜交的分析獲得的序列信息包括特定基因組位點的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、插入或缺失的存在與否。
正如上面提到的那樣，本發(fā)明的基于雜交的分析的雜交步驟明顯比酶法處理步驟長。因此，把來自多重基于雜交的分析的探針-基因組復(fù)合物合并后，酶法處理可以在可能發(fā)生任何顯著的解離和探針的假性重新退火，即與源自其它基于雜交的分析的靶多聚核苷酸重新退火。雜交步驟和酶法處理步驟的孵育時間的相對長度可以廣泛地變化，依賴于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的因素，例如探針和靶多聚核苷酸的復(fù)雜度和濃度、鹽濃度、輔助因子的存在與否、雜交加速劑的存在與否、溫度、處理步驟中使用的酶的類型、酶反應(yīng)的條件等。在一種情況下，雜交步驟的孵育時間比酶處理步驟的時間長100倍。在另一種情況下，雜交步驟的孵育時間比酶處理步驟的時間長10倍。在另一種情況下，基于雜交的分析的雜交步驟需要的孵育時間在幾個小時例如2-4小時到幾十小時例如24到72小時的范圍內(nèi)；在另一種情況下，這種孵育時間可以在從2到48個小時、或從2到24個小時的范圍內(nèi)。在另一種情況下，基于雜交的分析中的一個或多個酶法處理步驟需要的孵育時間在1到60分鐘的范圍內(nèi)；或者在另一種情況下，該步驟可能需要的孵育時間在1到30分鐘的范圍內(nèi)。
探針-基因組復(fù)合物和/或雜交步驟的其它反應(yīng)試劑或產(chǎn)物的酶法處理或加工可以包括使用具有幾種不同活性的一種或多種酶。處理所用的酶事實上包括任何酶，只要它們允許或增強能夠?qū)⒊晒Φ貦z測其目的靶序列的探針與不能檢測靶序列的那些探針區(qū)分開來的能力。通常情況下，這是通過選擇能夠以探針-基因組復(fù)合物作為底物并通過酶活性產(chǎn)生新的或修飾的結(jié)構(gòu)的酶來進行的。然而，酶類，特別是能夠識別并消化與其靶序列不雜交或錯誤雜交的探針的核酸酶，也在本發(fā)明的酶法處理的范圍內(nèi)。在一種情況下，酶法處理或加工包括用聚合酶、連接酶、核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、裂解酶、磷酸酶、激酶等進行處理或加工。在另一種情況下，酶法處理包括了用一種或多種其底物包含了核酸模板的酶進行處理。在另一種情況下，這樣的處理包括在模板驅(qū)動的反應(yīng)中使用至少一種DNA聚合酶或至少一種DNA連接酶進行處理。
在本發(fā)明中多路化(multiplexing)發(fā)生在兩個水平上。首先，基于雜交的分析被設(shè)計為測量多個位點上的一個或多個靶多聚核苷酸例如基因組片段的特征。在每個基于雜交的分析中被測量的位點的數(shù)目可以廣泛變化，其上限依賴于眾所周知的因素，包括使用的結(jié)果輸出裝置的容量、探針濃度和反應(yīng)時間之間的平衡、被測量的遺傳特性(例如，與性狀相關(guān)的研究需要非常大量的測量，遺傳鑒定則需要相對少的測量，不利的藥物反應(yīng)測試可能需要中等數(shù)量的測量，例如幾十到幾百個)等。在一種情況下，在每個基于雜交的分析中被分析的位點的數(shù)量在從幾十例如10到20，到成千上萬例如五萬到十萬的范圍內(nèi)。在另一種情況下，每個基于雜交的分析中的位點的數(shù)量在從10到40,000的范圍內(nèi)，或在從100到30,000的范圍內(nèi)，或在從100到20,000的范圍內(nèi)。其次，在將來自多重基于雜交的分析的分析產(chǎn)物進行合并，用于在單一的結(jié)果輸出設(shè)備上測定多個信號時也發(fā)生了多路化。通常，在本發(fā)明的被合并的基于雜交的分析產(chǎn)物的數(shù)量與待分析的不同基因組樣品的數(shù)量之間存在一一對應(yīng)；然而，本發(fā)明也包含了來自不同個體的不同數(shù)量的樣品通過不同數(shù)量的其產(chǎn)物被合并的基于雜交的分析進行分析的情況。這種多路化水平依賴于結(jié)果輸出裝置的容量和每個基于雜交的分析所測量的位點的數(shù)量。在一種情況下，可以被多路化的基于雜交的分析的數(shù)量是簡單的結(jié)果輸出裝置的容量，例如微陣列上的區(qū)塊的數(shù)量，除以在基于雜交的分析中被測量的位點的數(shù)量。例如在一種情況下，當每個測量需要兩個區(qū)塊時(例如等位基因1上純合，等位基因2上純合，或等位基因1和2上雜合)，具有100,000個區(qū)塊的微陣列可以被用作50個基于雜交的測試分析的結(jié)果輸出裝置，其中每個分析測量1000個位點的接合性。正如下面將更全面地討論的那樣，在微陣列區(qū)塊的使用、不同顏色的熒光染料、每個基于雜交的測試分析測量的位點的數(shù)量、結(jié)果輸出裝置的容量等之間進行的具體平衡，是本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員的常規(guī)設(shè)計選擇。
在一個實施方案中，本發(fā)明的可擴增的探針含有至少一個寡核苷酸標簽，它被復(fù)制和標記，以產(chǎn)生被標記的寡核苷酸探針。在該實施方案中，被標記的寡核苷酸探針與標簽互補序列的微陣列雜交以用于檢測。在該實施方案中，對于每個不同的基因組的每個不同的位點，存在獨一無二的被標記的寡核苷酸標簽。也就是說，由(i)寡核苷酸標簽的核苷酸序列和(ii)產(chǎn)生可檢測信號的標記物組成的配對與特定基因組的特定位點具有獨一無二的關(guān)聯(lián)。寡核苷酸標簽上的標記物的身份可以基于各種各樣的物理或化學性質(zhì)，包括但不限于光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、質(zhì)量、電荷等?；谶@些性質(zhì)的信號可以直接或間接地產(chǎn)生。例如，標記物可以是熒光分子，它與被擴增的寡核苷酸標簽共價結(jié)合，直接產(chǎn)生光學信號。此外，標記物可以含有多個組分，例如半抗原-抗體復(fù)合物，該組分反過來可以包含產(chǎn)生光學信號的熒光染料、產(chǎn)生能夠生成光學信號的產(chǎn)物的酶等。在優(yōu)選情況下，寡核苷酸標簽上的標記物是與被擴增的寡核苷酸標簽直接或間接結(jié)合的熒光標記物。在一種情況下，這種熒光標記物是從含有2到6種光譜可解析的熒光染料或量子點的組中選擇的熒光染料或量子點。
熒光標記物及其與寡核苷酸例如寡核苷酸標簽的結(jié)合在許多綜述中有描述，包括Haugland的Handbook of Fluoresent Probes and ResearchChemicals，Ninth Edition(Molecular Probes，Inc.，Eugene，2002)，Keller和Manak的《DNA Probes，2ndEdition(Stockton Press，New York，1993)，Eckstein主編的寡核苷酸Oligomucleotides and AnaloguesAPractical Approach(IRL Press，Oxford，1991)，Wetmur，Critical Reviewsin Biochemistry and Molecular Biology，26227-259(1991)等。用于本發(fā)明的具體方法在下面的參考文獻樣本中被公開Fung等的美國專利4,757,141，Hobbs，Jr.等的美國專利5,151,507，Cruickshank的美國專利5,091,519。在一種情況下，一種或多種熒光染料被用作標記物以標記靶序列，例如在Menchen等的美國專利5,188,934(4，7-二氯熒光素染料)，Begot等的美國專利5,366,860(光譜可分辨的若丹明染料)，Lee等的美國專利5,847,162(4，7-二氯若丹明染料)，Khanna等的美國專利4,318,846(醚取代的熒光素染料)，Lee等的美國專利5,800,996(能量轉(zhuǎn)移染料)，Lee等的美國專利5,066,580(氧雜蒽染料)，Mathies等的美國專利5,688,648(能量轉(zhuǎn)移染料)等中公開的那樣。標記也可以使用量子點進行，正如在下面的專利和專利公開中公開的那樣，它們在此引為參考6,322,901、6,576,291、6,423,551、6,251,303、6,319,426、6,426,513、6,444,143、5,990,479、6,207,392、2002/0045045、2003/0017264等。在本文中使用時，術(shù)語“熒光標記物”包括了通過一個或多個分子的熒光吸收和/或發(fā)射性質(zhì)傳送信息的信號基團。這種熒光性質(zhì)包括熒光強度、熒光壽命、發(fā)射光譜特征、能量轉(zhuǎn)移等。
易于摻入到標記的寡核苷酸中的可商購的熒光核苷酸類似物包括例如Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(AmershamBiosciences，Piscataway，N.J.，USA)、熒光素-12-dUTP、四甲基若丹明-6-dUTP、Texas Red-5-dUTP、Cascade Blue-7-dUTP、BODIPYFL-14-dUTP、BODIPYR-14-dUTP、BODIPYTR-14-dUTP、Rhodamine GreenTM-5-dUTP、Oregon Green488-5-dUTP、TexasRed-12-dUTP、BODIPY630/650-14-dUTP、BODIPY650/665-14-dUTP、Alexa Fluor488-5-dUTP、AlexaFluor532-5-dUTP、Alexa Fluor568-5-dUTP、AlexaFluor594-5-dUTP、Alexa Fluor546-14-dUTP、熒光素-12-UTP、四甲基若丹明-6-UTP，Texas Red-5-UTP、Cascade Blue-7-UTP、BODIPYFL-14-UTP、BODIPYTMR-14-UTP、BODIPYTR-14-UTP、Rhodamine Green-5-UTP、Alexa Fluor488-5-UTP、AlexaFluor546-14-UTP(Molecular Probes，Inc.Eugene，Oreg.，USA)。用于定制合成(custom synthesis)具有其它熒光團的核苷酸的方案可以獲得。Henegariu等的“Custom Fluorescent-Nucleotide Synthesis as anAlternative Method for Nucleic Acid Labeling”，Nature Biotechnol.18345-348(2000)，其公開的內(nèi)容在此以其全文引為參考。
此外，其它可用于合成后結(jié)合的熒光團包括，特別是，AlexaFlnor350、Alexa Fluor532、Alexa Flnor546、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPYR6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹磺酰、lissamine若丹明B、Marina Blue、Oregon Green488、OregonGreen514、Pacific Blue、若丹明6G、若丹明綠、若丹明紅、四甲基若丹明、Texas Red(可以從Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.，USA獲得)，以及Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.USA，等)。
FRET串聯(lián)熒光團也可以使用，例如PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red以及APC-Cy7，此外PE-Alexa染料(610，647，680)和APC-Alexa染料也可以使用。
金屬銀粒子可以被鍍在陣列的表面上以增強結(jié)合在陣列上的熒光標記的寡聚物的信號。Lakowicz等，BioTechniques 3462-68(2003)。
生物素或其衍生物也可以用作檢測性寡核苷酸上的標記物，然后被可檢測的標記的親和素/鏈霉親和素衍生物(例如藻紅蛋白偶聯(lián)的鏈霉親和素)或可檢測的標記的抗生物素抗體結(jié)合?？梢约尤朊攸S毒甙(digoxigenin)作為標記物，然后被可檢測的標記的抗毛地黃毒甙抗體(例如熒光素偶聯(lián)的抗毛地黃毒甙抗體)結(jié)合。氨基烯丙基-dUTP殘基可以被加入到檢測性寡核苷酸中，然后與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)衍生(derivitized)的熒光染料偶聯(lián)，例如前面列出的那些。一般來說，任何偶聯(lián)對的成員都可以被加入到檢測性寡核苷酸中，只要可檢測的標記的偶聯(lián)配偶體可以被結(jié)合并允許檢測。在本文中使用的術(shù)語“抗體”是指任何類型的抗體分子或其任何亞片段，例如Fab。
其它適合用于檢測性寡核苷酸的標記物可以包括熒光素(FAM)、毛地黃毒甙、二硝基苯酚(DNP)、丹磺酰、生物素、溴代脫氧尿苷(BrdU)、六聚組氨酸(6xHis)、磷光體-氨基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)，或任何其它適合的標記物。在一個實施方案中，下面的半抗原/抗體對被用于檢測，其中每個抗體用可檢測的標記物衍生生物素/α-生物素、毛地黃毒甙/α-毛地黃毒甙、二硝基苯酚(DNP)/α-DNP、5-羧基熒光素(FAM)/α-FAM。
正如上面提到的那樣，寡核苷酸標簽可以被間接地標記，特別是用隨后可以被捕獲試劑結(jié)合的半抗原標記，例如在Holtke等的美國專利5,344,757、5,702,888和5,354,657，Huber等的美國專利5,198,537，Miyoshi的美國專利4,849,336，Misiura和Gait的PCT公開WO 91/17160等中公開的那樣。本發(fā)明可以用許多不同的半抗原-捕獲試劑對用于，既可用于靶序列也可用于與靶序列一起使用的檢測性寡核苷酸，如下文的描述。半抗原的例子包括生物素、脫生物素(des-biotin)和其它的衍生物、二硝基苯酚、丹磺酰、熒光素、CY5和其它染料、毛地黃毒甙等。對于生物素來說，捕獲試劑可以是親和素、鏈霉親和素或抗體?？贵w可以被用作其它半抗原的捕獲試劑(許多染料-抗體對可以商購，例如從Molecular Probes公司)。
圖1A和1B圖解了本發(fā)明的一個實施方案的操作，該實施方案用于特定的基于雜交的分析(該分析基于兩個寡核苷酸成分的模板驅(qū)動連接)?；陔s交的分析分別在來自基因組G1的DNA樣品和來自基因組G2的DNA樣品上進行。分別含有寡核苷酸標簽t1到tK的探針p1到pK(100)和分別含有寡核苷酸標簽tK+1到t2K的探針p1到pK(102)，在分開的反應(yīng)混合物中分別與基因組G1 DNA和基因組G2 DNA結(jié)合，條件是使所述探針與其各自的含有靶位點的DNA鏈(104)和(106)特異雜交，對于基因組G1是L1從LK((108)到(110)，對于基因組G2)是(112)到(114)。經(jīng)過一段時間的孵育后，包含有后續(xù)步驟的酶的識別結(jié)構(gòu)的探針-基因組復(fù)合物形成(分別為(118)和(116))，該孵育時間依賴于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的參數(shù)，例如靶的復(fù)雜度、探針濃度、溫度等，將在下文更全面地討論。雜交步驟的產(chǎn)物被合并(120)，并用適當?shù)拿柑幚碛糜诰唧w的測試分析。在圖1A的例子中，探針p1到pK與它們對應(yīng)的模板形成完全配對的雙鏈體，將它們用常規(guī)的連接酶進行連接。探針p1到pK中每個的上游部分可以任選具有抗核酸酶的3’末端，這種情況下，連接產(chǎn)生的分子能夠抗3’-核酸外切酶的消化。(或者，如果連接產(chǎn)生了環(huán)狀的探針，也可以獲得同樣的結(jié)果)。在這種情況下，酶法處理步驟包含了用連接酶處理然后用3’-核酸外切酶處理，從而產(chǎn)生了可擴增的探針。3’-核酸外切酶使未能連接的探針消化并不能被擴增，舉例，這是因為不存在允許所用的連接酶的識別結(jié)構(gòu)形成的靶多聚核苷酸。在探針-基因組復(fù)合物(121)形成后，只要兩個探針成分與其對應(yīng)的模板形成完全配對的雙鏈體時，探針成分的末端(122)就被連接在一起。在這樣的連接之后(象這里舉例的那樣)，被成功連接的探針的寡核苷酸標簽被擴增和標記(124)，從而產(chǎn)生了被標記的寡核苷酸標簽，它們?nèi)缓笈c微陣列(132)進行特異性雜交，如圖1B所示。在該圖中，為方便起見，對應(yīng)于每個不同基因組的所有標簽互補序列被成組一起顯示在8x8的區(qū)塊內(nèi)，例如虛線指示的區(qū)塊(134)。這樣的分組對于本發(fā)明的實踐來說不是必需的，相應(yīng)的標簽互補序列可以在微陣列上互相混合，只要它們的地址已知。在該圖解中，顯示了四個8×8的區(qū)塊，展示了可以從每個雜交位點收集到的三種類型的信號。圖解假定每個位點有兩個可能的等位基因存在，并且個體可以在任何一個等位基因上是純合的，也可以在該等位基因上是雜合的?？招膱A圈代表著在特定位點的第一個等位基因上是純合的個體的信號，黑色實心圓圈代表著在該位點的第二個等位基因上是純合的個體的信號，灰色實心圓圈代表著在該位點的可能的等位基因上是雜合的個體的信號。
圖1C-1E中例舉的方法顯示了從測試分析獲得的信息可以通過雜交位點的地址和信號特征進行編碼。根據(jù)這些例子選擇具體的實施方案可能需要本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的平衡設(shè)計，例如相對于能夠測量多種熒光染料的發(fā)射的更復(fù)雜的檢測系統(tǒng)，探針的花費減少。圖1C顯示了示意圖，其中包含在橢圓形(140)中的兩個雜交位點(142)和(144)各含有不同的標簽互補序列，它們與單一位點的不同等位基因相關(guān)。在該示意圖中，熒光染料具有四種不同的發(fā)射條帶(分別用灰色、交叉平行線、點狀和黑色的方塊表示)，對應(yīng)于四個不同的個體；雜交位點(142)和(144)對應(yīng)于單一位點J上的兩個不同等位基因。在這樣的實施方案中，必須產(chǎn)生的具有不同寡核苷酸標簽的探針的數(shù)量大大減少；但是需要能夠同時分辨四個不同發(fā)射條帶的檢測系統(tǒng)。在該例子中，從兩個雜交位點的熒光發(fā)射中測定了四個不同個體的每個個體的位點的接合性。圖1D顯示了上面討論的示意圖與圖1A-1B的關(guān)系。也就是說，每個不同個體的每個不同位點分派有不同的寡核苷酸標簽，這些標簽可以用三種方式之一進行標記，這依賴于個體是否在等位基因1或等位基因2中是純合的、或在等位基因1和等位基因2中是雜合的。因此，橢圓形(150)識別了分別對應(yīng)于個體1到4中同樣位點的四個雜交位點(152)、(154)、(156)和(158)，并通過兩種熒光染料的熒光發(fā)射確定每個這些個體中位點J的接合性。
圖1E顯示了編碼雜交位點的信號的另一個示意圖?；蚪MG1到GN(160)被顯示為分開的線(162)到(172)，每個按照從左到右的次序含有位點L1到LK。在每個基因組的每個位點上，探針被顯示為雜交。在該示意圖中，位點成對分組(176)，其中一個基因組中的每一對都具有同樣的寡核苷酸標簽，不同基因組中同樣的對具有不同的寡核苷酸標簽。在該流程中，通過四種光譜可分辨的染料的發(fā)射確定兩個雙等位基因位點的接合性。在單一雜交位點上，發(fā)射信號被收集到4個通道中，以便兩個通道給出一個位點的接合性，另兩個通道給出第二個位點的接合性。
正如上面討論的那樣，可擴增的探針是從已經(jīng)在特異性結(jié)合到靶基因組上的后續(xù)反應(yīng)中被修飾的探針形成的。修飾允許探針可以被選擇，例如通過除去未修飾探針或與它們分離、通過破壞未修飾的探針和/或非靶多聚核苷酸、或通過其它這樣的方法。修飾可以包括化學或酶法修飾，例如連接或用聚合酶延伸。在一種情況下，探針通過連接進行修飾，以便它們形成閉合環(huán)狀DNAs。在另一種情況下，探針通過核酸聚合酶延伸以摻入含有捕獲基團例如生物素的修飾核苷酸。在另一種情況下，上述的兩種修飾被一個或多個模板驅(qū)動的酶促反應(yīng)所影響。探針的例子包括分子倒置探針、扣鎖探針、滾環(huán)探針、帶有“郵政編碼”標簽的基于連接的探針、單堿基延伸探針等，例如Hardenbol等，Nature Biotechnology，21673-678(2003)，Nilsson等，Science，2652085-2088(1994)，Baner等，Nucleic Acids Research，265073-5078(1998)，Lizardi等，Nat.Genet.，19225-232(1998)，Gerry等，J.Mol.Biol.，292251-262(1999)，F(xiàn)an等，Genome Research，10853-860(2000)，國際專利公開WO 2002/57491和WO 2000/58516，美國專利6,506,594和4,883,750等，這些文獻在此引為參考。在一種情況下，本發(fā)明的探針是分子倒置探針，例如在Hardenbol等(前面有引證)和Willis等的美國專利6,858,412中公開的那些，這些文獻在此引為參考。在分子倒置探針的情況下，可擴增的探針的形成是通過在靶基因組上的模板驅(qū)動的反應(yīng)中將探針環(huán)化，然后用一種或多種非環(huán)化多聚核苷酸(例如靶基因組、未連接的探針、探針連環(huán)體(concatatemers)等)的核酸外切酶消化。在另一種情況下，探針含有寡核苷酸標簽和靶特異性的區(qū)域，通過聚合酶反應(yīng)進行延伸以加入帶有捕獲基團的核苷酸，例如生物素，如同在Fan等(見前面的引證)和Mao等的PCT公開WO 02/097113中所公開的那樣。可擴增的探針通過在用捕獲試劑，例如抗親和素化(avidinated)的磁珠，衍生的固相支持物上捕獲被延伸的探針，然后將它們從反應(yīng)混合物中分離來形成。
有多種終止劑-捕獲基團組合可以獲得。優(yōu)選情況下，雙脫氧核苷三磷酸被用做終止劑。在一種情況下，捕獲基團可以被這樣的用炔基氨基基團衍生的終止劑所結(jié)合，如同在Hobbs等的美國專利5,047,519和Taing等的國際專利公開WO 02/30944中所教的那樣，在此引為參考。優(yōu)選的捕獲基團包括生物素或生物素衍生物，例如脫生物素，它們可以用鏈霉親和素或親和素或可商購的抗體、以及二硝基苯酚、毛地黃毒甙、熒光素和若丹明來進行捕獲，所有這些試劑都可用作NHS酯，可以與炔基氨基衍生的終止劑反應(yīng)。這些試劑以及用于這些化合物的抗體捕獲試劑可以從Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oreg.)獲得。
基于雜交的分析示例有許多基于雜交的分析，其中包含了與靶多聚核苷酸例如基因組DNA片段形成結(jié)構(gòu)或復(fù)合物的雜交步驟，以及酶法處理的步驟，其中一種或多種酶或者識別這些結(jié)構(gòu)或復(fù)合物為底物，或者由于底物被這些結(jié)構(gòu)或復(fù)合物保護而不能識別底物。具體來說，這樣的分析被廣泛用在多重格式中，以同時在多個位點分析DNA樣品，例如等位基因特異性的多重PCR、陣列引物延伸(APEX)技術(shù)、溶液相引物延伸或連接分析等，它們被描述在下列示例的參考文獻中Syvanen，NatureGenetics Supplement，37S5-S10(2005)；Shumaker等，Hum.Mut.，7346-354(1996)；Huang等的美國專利6,709,816和6,287,778；Fan等的美國專利公開2003/0003490；Gunderson等的美國專利公開2005/0037393；Hardenbol等，Nature Biotechnology，21673-678(2003)；Nilsson等，Science，2652085-2088(1994)；Baner等，Nucleic AcidsResearch，265073-5078(1998)；Lizardi等，Nat.Genet.，19225-232(1998)；Gerry等，J.Mol.Biol.，292251-262(1999)；Fan等，GenomeResearch，10853-860(2000)；國際專利公開WO 2002/57491和WO2000/58516；美國專利6,506,594和4,883,750，等。
在一種情況下，基于雜交的分析包括了環(huán)化探針、例如扣鎖探針、滾環(huán)探針、分子倒置探針、用于多重PCR的線性擴增分子等，例如在美國專利5,871,921、6,235,472、5,866,337和日本專利JP.4-262799中公開的扣鎖探針，在Aono等JP-4-262799和Lizardi的美國專利Nos.5,854,033、6,183,960、6,344,239中公開的滾環(huán)探針，在Hardenbol等(參見上文引證)和Willis等的美國專利6,858,412中公開的分子倒置探針，以及在Faham等的美國專利公開2003/0104459中公開的線性擴增分子，這些文獻在此引為參考。這些探針是合適的，因為未環(huán)化的探針可以被單鏈核酸外切酶消化，從而極大地降低由雜散的擴增等引起的背景噪音。在分子倒置探針(MIPs)、扣鎖探針和滾環(huán)探針的情況下，產(chǎn)生標記的靶序列的結(jié)構(gòu)是通過在靶多聚核苷酸上，在模板驅(qū)動的反應(yīng)中環(huán)化探針的線性形式，然后用核酸外切酶例如核酸外切酶I對反應(yīng)混合物中的未環(huán)化的多聚核苷酸、例如靶多聚核苷酸、未連接的探針、探針連環(huán)體等進行消化而形成的。
圖2A-2B顯示了分子倒置探針以及這些這些探針是如何被用于本發(fā)明的。如圖2A所示，在允許靶特異性區(qū)域1(216)和靶特異性區(qū)域2(218)與每個分開的分析中相應(yīng)的靶多聚核苷酸(200)的互補區(qū)域形成穩(wěn)定的雙鏈體的情況下，將一組(或一套)線性的探針分子(如圖所示用于樣品1)與基因組樣品1到K中的每種分別混合。靶特異性區(qū)域的末端彼此之間可以互相拼接(被“缺刻”分開)，或者在它們之間可能有幾個核苷酸(例如1-10個核苷酸)的間隙(220)，這依賴于所用的分子倒置探針分析的實施方案。在經(jīng)過足夠允許特異性雜交進行的時間后，分析混合物1到K被合并(222)，用于隨后的酶處理步驟。在一種分子倒置探針分析中，合并的混合物被分成四份等份試樣，分別進行酶法處理(分別進行A、C、G或T延伸，然后進行連接和核酸外切酶處理)，然后將等份試樣重新合并，將標記的寡核苷酸標簽與結(jié)果輸出平臺進行特異性雜交。
在與靶特異性區(qū)域雜交后，兩個靶特異性區(qū)域的末端通過連接反應(yīng)或延伸反應(yīng)后再進行連接反應(yīng)、即所謂的“空隙填充反應(yīng)”被共價連接。后一種反應(yīng)的進行是通過用DNA聚合酶延伸一個靶特異性區(qū)域的游離3’-末端，以至于延伸的末端與另一個靶特異性區(qū)域具有5’-磷酸或類似基團的末端拼接，以允許連接。在一種情況下，每個分子倒置探針都具有圖2A中所示的結(jié)構(gòu)。除了靶特異性區(qū)域(216和218)之外，這樣的探針在序列中可以包含第一個引物結(jié)合位點(202)、裂解位點(204)、第二個引物結(jié)合位點(206)、用于制造含有寡核苷酸標簽(210)的標記的靶序列的一個末端的第一個臨近標簽的序列(208)(通常為限制性核酸內(nèi)切酶位點和/或引物結(jié)合位點)，以及用于制造標記的靶序列的另一個末端的第二個臨近標簽的序列(214)。此外，在后面的步驟中也可以通過使用含有水解位點的引物進行擴增來加入裂解位點(204)。在操作中，在靶特異性區(qū)域進行特異性雜交和連接后，除了環(huán)化的探針，將反應(yīng)混合物用優(yōu)選消化所有單鏈核酸核酸外切酶進行處理。經(jīng)過這樣的處理后，用在引物(202)和引物(206)之間裂解探針的裂解試劑處理環(huán)化的探針，使得結(jié)構(gòu)變?yōu)榫€性(230)。裂解位點(204)及其相應(yīng)的裂解試劑是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的設(shè)計選擇。在一種情況下，裂解位點(204)是包含了含有尿嘧啶核苷酸的序列的片段，裂解試劑用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理，然后加熱。環(huán)化的探針開環(huán)后，線性的產(chǎn)物通過例如PCR使用引物(232)和(234)進行擴增，形成擴增子(236)。然后對寡核苷酸標簽(210)進行擴增和標記，與標簽互補序列的微陣列例如GenFlex陣列(Affymetrix，Santa Clara，Calif.)等進行特異性雜交。
圖2B顯示了為一個位點的四種可選核苷酸中的每種產(chǎn)生不同信號、例如不同的熒光信號的標記示意圖，其中微陣列被用于檢測由標記的寡核苷酸標簽產(chǎn)生的信號。在該示意圖中，從四個等份試樣(250)到(256)(分別用寡核苷酸標簽t23(251)、t24(253)、t25(255)和t26(257)圖示)中的每個獲得的擴增子(236)分別與引物對(280)和(282)、(284)和(286)、(288)和(290)以及(292)和(294)結(jié)合，并通過例如PCR進行擴增。引物(280)、(284)、(288)和(292)已經(jīng)分別連接有光譜可分辨的熒光染料FA、FC、FG和FT。在擴增之后，相應(yīng)的產(chǎn)物被合并、變性并加入(258)到微陣列(260)上，以便每個寡核苷酸標簽與其標簽互補序列特異性雜交。然后用常規(guī)的儀器例如GeneChipScanner 3000(Affymetrix，Santa Clara，CA)或類似的儀器收集來自微陣列(260)的區(qū)塊的熒光信號并進行分析。
使用固相支持物的基于雜交的分析在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，適合于本發(fā)明的使用微陣列等平臺進行多重基于雜交的分析的方法是眾所周知的。用于在固相支持物例如微陣列上添加標記序列的選擇條件和材料的指導(dǎo)可以在文獻中發(fā)現(xiàn)，例如Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，26227-259(1991)，DeRisi等，Science，278680-686(1997)，Chee等，Science，274610-614(1996)，Duggan等，Nature Genetics，2110-14(1999)，Schena主編的MicroarraysA Practical Approach(IRL Press，Washington，2000)，F(xiàn)reeman等，Biotechniques，291042-1055(2000)等參考文獻。用于執(zhí)行可重復(fù)的、可控制的雜交反應(yīng)的方法和裝置在美國專利Nos.5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中有描述，每篇都在此引為參考。雜交條件一般包括低于大約1M的鹽濃度，更經(jīng)常低于大約500mM以及低于大約200mM。雜交溫度可以低至5℃，但是在典型情況下高于大約22℃，更典型高于大約30℃，優(yōu)選超過大約37℃。雜交通常在嚴格條件下進行，即在該條件下探針將與完全互補的靶序列穩(wěn)定地雜交，但是不能與具有一個或多個誤配的序列穩(wěn)定地雜交。雜交條件的嚴格性依賴于幾種因素，例如探針序列、探針長度、溫度、鹽濃度、有機溶劑例如甲酰胺的濃度等。對任何具體的實施方案來說如何選擇這些因素是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常的設(shè)計選擇的問題。通常情況下，嚴格條件被選擇為在特定的離子強度和pH下，比特定序列的Tm低大約5℃。示例性的雜交條件包括在pH7.0到8.3和溫度至少25℃時，鹽濃度至少0.01M到大約1M Na離子濃度(或其它鹽)。其它的示例性雜交條件包括如下5×SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA，pH7.4)。
將標記的靶序列添加到GenFlex微陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA)上的示例性雜交步驟如下將標記的靶序列在95-100℃變性10分鐘，在冰上迅速冷卻2-5分鐘。微陣列用6 X SSPE-T(0.9M NaCl，60mM NaH2PO4，6mM EDTA(pH7.4)，0.005％Triton X-100)+0.5mg/ml BSA預(yù)雜交幾分鐘，然后用120μL雜交溶液(描述見下文)在42℃的雜交箱中以40RPM旋轉(zhuǎn)，雜交2小時。雜交溶液的組成是3MTMACL(四甲基氯化銨)，50mM MES((2-[N-嗎啉代]乙磺酸)鈉鹽)(pH6.7)，0.01％的Triton X-100，0.1mg/ml鯡魚精子DNA，任選50pM熒光素標記的對照寡核苷酸，0.5mg/ml BSA(Sigma)以及標記的靶序列，總反應(yīng)體積大約為120L。微陣列用1 X SSPE-T在室溫清洗兩次，每次大約10秒，然后用1 X SSPE-T在雜交箱中以40RPM旋轉(zhuǎn)清洗，于40℃15-20分鐘。然后將微陣列在流體臺(例如型號FS400，Affymetrix，Santa Clara，CA)上用6 X SSPE-T在22℃清洗10次。根據(jù)所用的標記物的性質(zhì)，例如直接或間接，可能還需要其它的處理步驟。含有標記的靶序列的微陣列可以在共焦掃描儀(例如可以從Affymetrix購買到的)掃描，所述掃描儀具有每個區(qū)塊60-70個像素的分辨率和濾光片和適合于所用的標記物的其它設(shè)置。GeneChip軟件(Affymetrix)或類似軟件可用于將圖象文件轉(zhuǎn)化為數(shù)字文件，以用于進一步的數(shù)據(jù)分析。
樣品制備用于本發(fā)明的含有靶多聚核苷酸例如基因組DNA片段的樣品或樣本可以來自各種各樣的來源，包括細胞培養(yǎng)物、動物或植物組織、病人活組織切片、環(huán)境樣品等。使用常規(guī)的技術(shù)制備樣品用于本發(fā)明的分析，所用技術(shù)一般依賴于獲得樣品或樣本的來源。
在對樣品進行反應(yīng)前，通常希望對樣品進行一個或多個樣品制備操作。典型情況下，這些樣品制備操作包括例如從全細胞樣品、病毒等中提取細胞內(nèi)物質(zhì)如核酸等的操作。
對于那些全細胞、病毒或其它組織樣品將被分析的實施方案來說，在繼續(xù)各種樣品制備操作之前，一般需要從細胞或病毒中提取核酸。因此，在樣品收集后，可以將核酸從收集的細胞、病毒外殼中釋放到粗提液中，然后進行其它的處理以制備用于后續(xù)操作的樣品，例如雜蛋白(結(jié)合了DNA的)的變性、純化、過濾、脫鹽等。將核酸從樣品細胞或病毒釋放出來，以及結(jié)合了DNA的蛋白的變性一般通過化學、物理或電解裂解的方法進行。例如，化學方法一般使用裂解試劑破壞細胞并從細胞中提取核酸，然后用離液序列高的鹽例如異硫氰酸胍或尿素處理提取液，以變性任何雜蛋白和潛在的干擾蛋白。一般來說，當使用化學提取和/或變性方法時，適合的試劑可以被摻入到樣品制備倉、分離的附加倉中，也可以從外部導(dǎo)入。
在提取后，通常希望將核酸與粗提液中的其它成分、例如變性的蛋白、細胞膜顆粒、鹽等分開。顆粒物質(zhì)的除去一般通過過濾、絮凝等方法進行。在裝置中可以方便地引入各種過濾類型。此外，當使用化學變性方法時，可能希望在進行后面的步驟之前先對樣品脫鹽。樣品的脫鹽和核酸的分離一般可以在單個步驟中進行，例如通過將核酸結(jié)合在固相上并洗掉雜質(zhì)鹽或?qū)悠愤M行凝膠過濾層析、使鹽通過透析膜等。適合于核酸結(jié)合的固相支持物包括例如硅藻土、二氧化硅(例如玻璃棉)等。適合的凝膠排阻介質(zhì)在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)也是眾所周知的，也可以容易地摻入到本發(fā)明的裝置中，可以從例如Pharmacia和SigmaChemical公司購買到。
在某些應(yīng)用例如測量病人血液的罕見細胞中的靶多聚核苷酸時，在進行分析前可以進行富集步驟，例如通過免疫磁性分離。這樣的分離或富集可以使用各種本技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)和材料來進行，象下列被引為參考的代表性文獻中所公開的那樣Terstappen等的美國專利6,365,362；Terstappen等的美國專利5,646,001；Rohr等的美國專利5,998,224；Kausch等的美國專利5,665,582；Kresse等的美國專利6,048,515；Kausch等的美國專利5,508,164；Miltenyi等的美國專利5,691,208；Molday的美國專利4,452,773；Kronick的美國專利4,375,407；Radbruch等的Methods in Cell Biology，Vol42，chapter 23(Academic Press，New York，1994)；Uhlen等的Advances inBiomagnetic Separation(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等，Urology，58386-392(2001)；Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.，954589-4594(1998)；Zigeuner等，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等，Seminars in Surgical Oncology，20304-311(2001)。
在一種情況下，用于分析的基因組DNA使用標準的可商購的DNA提取試劑盒獲得，例如PureGeneDNA Isolation Kit(Gentra Systems，Minneapolis，MN)。在另一種情況下，為了用含有從大約1000到50,000個探針的多重基于雜交的分析來分析人類基因組DNA，可以使用含量在大約200ng到大約1μg的范圍內(nèi)的DNA樣品。當樣品材料稀缺時，在分析之前，可以通過全基因組擴增或類似技術(shù)擴增樣品DNA，以增加可用于分析的DNA的總量。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)有幾種全基因組、或部分基因組擴增技術(shù)，例如在下列引為參考的文獻中Telenius等，Genormics，13718-725(1992)；Cheung等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9314676-14679(1996)；Dean等，Genome Research，111095-1099(2001)；美國專利Nos.6,124,120、6,280,949、6,617,137等。
上面的教導(dǎo)其目的在于說明本發(fā)明，其細節(jié)并不對本發(fā)明權(quán)利要求的范圍構(gòu)成限制。在描述本發(fā)明的優(yōu)選示范實施方案時，對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說，顯然可以在其中進行各種改變和修飾而不背離本發(fā)明，附隨的權(quán)利要求其目的是覆蓋位于本發(fā)明的真正本質(zhì)和范圍內(nèi)的所有這樣的改變和修飾。
權(quán)利要求
1.同時分析多個基因組以獲得每個基因組中一個或多個位點的序列信息的方法，該方法包括下列步驟為每個基因組提供一組探針，該組中的每個探針對于基因組的位點來說是特異性的；將每組探針分別與其相應(yīng)的基因組雜交，以在分開的反應(yīng)混合物中形成探針-基因組復(fù)合物；將分開的反應(yīng)混合物合并，并對探針-基因組復(fù)合物進行酶法處理以形成可擴增的探針；對可擴增的探針進行擴增和標記以形成標記的探針，使得對于每個不同基因組的每個不同位點來說有一個獨一無二的標記的探針；以及將標記的探針與微陣列上它們相應(yīng)的互補序列進行特異性雜交，使得與微陣列特異性雜交的標記探針的存在與否表明所述多個基因組中每個的一個或多個位點中每個的序列信息。
2.權(quán)利要求1的方法，其中來自每個所述組的每個所述探針都含有寡核苷酸標簽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的擴增和標記步驟包括擴增和標記所述探針中的所述寡核苷酸標簽，使得對于每個不同基因組的每個不同位點來說有獨一無二的標記的寡核苷酸標簽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述特異性雜交步驟包括將所述標記的寡核苷酸標簽與所述微陣列上它們相應(yīng)的標簽互補序列進行特異性雜交，使得所述微陣列上的標記的寡核苷酸標簽的存在與否表明所述每個基因組的所述一個或多個位點中每個的所述序列信息。
5.權(quán)利要求4的方法，其中每個標記的寡核苷酸標簽具有核苷酸序列和用于產(chǎn)生光學信號的標記物，以及其中每個所述基因組的每個所述位點被至少一個標記的寡核苷酸標簽的核苷酸序列和標記物所鑒定。
6.權(quán)利要求5的方法，其中對于不同位點的所述寡核苷酸標簽是不同的，以及其中在所述多個基因組中中每個的至少一個位點中，對于不同的所述基因組的相同位點來說，有一個以上的寡核苷酸標簽是相同的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述一個以上的相同的所述寡核苷酸標簽每個用不同的光譜可分辨的熒光染料標記。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述序列信息包括所述位點上的單核苷酸多態(tài)性、核苷酸插入或核苷酸缺失的身份。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述酶法處理所述探針-基因組復(fù)合物的步驟包括使用DNA聚合酶在模板驅(qū)動的反應(yīng)中延伸探針。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述酶法處理所述探針-基因組復(fù)合物的步驟包括在模板驅(qū)動的反應(yīng)中將探針的第一個組分與探針的第二個組分連接。
11.權(quán)利要求8的方法，其中每個所述探針是可環(huán)化的探針。
12.權(quán)利要求11的方法，其中每個所述可環(huán)化的探針是分子倒置探針，以及其中每個所述可擴增的探針是環(huán)化的分子倒置探針。
13.同時分析多個樣品以確定一個或多個被分析物的存在或含量的方法，該方法包括下列步驟為每個樣品提供一組探針，其中包含了針對每個被分析物的至少一個探針，該組中的每個探針對于至少一個被分析物來說是特異性的，以及該組中的每個探針都連接有寡核苷酸標簽；將每組探針分別與其相應(yīng)的樣品反應(yīng)，以在分開的反應(yīng)混合物中形成探針-被分析物復(fù)合物；將分開的反應(yīng)混合物合并，并對探針-被分析物復(fù)合物進行酶法處理以形成可擴增的探針；對可擴增的探針進行擴增和標記以形成標記的寡核苷酸標簽，使得對于每個不同樣品的每個不同被分析物來說有獨一無二的標記的寡核苷酸標簽；以及將標記的寡核苷酸標簽與微陣列上它們相應(yīng)的互補序列進行特異性雜交，使得與微陣列特異性雜交的標記的寡核苷酸標簽的存在與否表明所述多個樣品中每個的一個或多個被分析物中每個的存在或含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了對多個基于雜交的分析進行多路結(jié)果輸出的方法，這些分析測試中每個都包含了一個或多個雜交或退火步驟以及一個或多個酶法處理步驟。一方面，本發(fā)明允許通過將一組探針與不同的基因組分別進行雜交，以在分開的反應(yīng)混合物中形成探針—基因組復(fù)合物組，然后將它們合并并進行酶法處理以形成可擴增的探針，從而對多個基因組進行同時分析。從這些可擴增的探針可以產(chǎn)生標記的探針，使得對于每個不同的基因組的每個不同位點來說存在獨一無二的標記探針，然后將這些探針在微陣列上與它們相應(yīng)的互補序列進行特異性雜交。另一方面，從可擴增的探針可以產(chǎn)生標記的寡核苷酸標簽。本發(fā)明適用于多重基于雜交的分析，以檢測從許多不同個體獲得的基因組樣品的特征。通過對不同個體的樣品分別進行雜交，然后將它們合并進行酶法處理的步驟，人們可以利用雜交反應(yīng)和酶反應(yīng)之間天然的反應(yīng)速度差異，以確保在單一結(jié)果輸出平臺上對產(chǎn)物分析的多個分析。
文檔編號G06F19/00GK101087890SQ200580031840
公開日2007年12月12日 申請日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月26日
發(fā)明者保羅·哈頓伯爾, 喬治·卡林－諾伊曼, 托馬斯·D·威利斯, 馬尼施·賈殷, 尼古拉斯·納克萊里奧 申請人:帕拉列勒生物科學公司