一種a型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接elisa檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，提供了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接ELISA檢測方法，該方法以制備的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素為抗原，一是用來免疫家兔制備高免血清，二是濃縮、純化后作為間接ELISA的包被抗原；檢測方法包括以下步驟：(1)包被(2)封閉(3)加待檢樣品(4)加入二抗(5)顯色(6)終止(7)結(jié)果判定。此方法具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、可重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，另外此方法可以大批量檢測樣品，為該病的檢測和研究提供了有效，簡便的血清學(xué)診斷方法。
【專利說明】
-種A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體的間接EL ISA檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體的間 接化ISA檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣芙膜梭菌(C.per打ingens)又稱魏氏梭菌(C.welchii)，是一種正常情況下人 和動物胃腸道中寄生的條件致病菌。產(chǎn)氣芙膜梭菌根據(jù)其分泌的四種主要外毒素(α、0、ε、 t)分為A、B、C、D、E五個亞型。A型產(chǎn)氣芙膜梭菌分泌的主要致病外毒素是α毒素。α毒素是一 種依賴于鋒離子的多功能性金屬酶，能破壞宿主細(xì)胞細(xì)胞膜表面的憐脂，從而破壞細(xì)胞膜 的功能。該菌能夠感染多種動物，導(dǎo)致壞死性腸炎和腸毒血癥等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的 經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體水平是評價動物對產(chǎn)氣芙膜梭菌病抵抗力的指標(biāo)，小白鼠 毒素中和試驗(yàn)是檢測A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體的經(jīng)典方法，雖然準(zhǔn)確可靠，但費(fèi)時、費(fèi)工， 需要血清樣品和動物的量也比較大，而且可能因?yàn)閯游锏膫€體差異造成結(jié)果不準(zhǔn)確;在快 速診斷上也難W適應(yīng)實(shí)踐需要。而卵憐脂水解抑制試驗(yàn)欠敏感，且重復(fù)性差，操作繁瑣，難 于推廣應(yīng)用。間接血凝實(shí)驗(yàn)，需要制備血凝抗原，較為復(fù)雜，難W在生產(chǎn)實(shí)踐中普及。運(yùn)些方 法受到很多條件的限制，難W適應(yīng)當(dāng)前控制產(chǎn)氣芙膜梭菌病的流行W及對該病的研究檢測 的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的上述情況，本發(fā)明提供了提供了一種A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體 的間接化ISA檢測方法，該方法W制備的A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素為抗原，一是用來免疫家 兔制備高免血清，二是濃縮、純化后作為間接化ISA的包被抗原；檢測方法包括W下步驟： (1)包被(2)封閉（3)加待檢樣品（4)加入二抗(5)顯色(6)終止(7)結(jié)果判定。此方法具有特 異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，另外此方法可W大批量檢測樣品，為該病的 檢測和研究提供了有效，簡便的血清學(xué)診斷方法。
[0005] 發(fā)明人在本發(fā)明中所采用的A型產(chǎn)氣芙膜梭菌采用現(xiàn)有菌種，特別選自菌種 NCTC528(保藏于National Collection of Type Qiltures英國國家典型培養(yǎng)物保藏中屯、， 保藏號:NCTC528)，可通過現(xiàn)有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現(xiàn)有技術(shù)中可直接獲得 的材料，不需進(jìn)行單獨(dú)的生物保藏。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案中主要含有如下幾個特殊之處：
[0007] 1 A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗原的制備：
[000引A型產(chǎn)氣芙膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37Γ厭氧培養(yǎng)36h，選取 單個的菌落接種液體硫乙醇培養(yǎng)基增菌12小時，然后將增菌液按體積百分比5%接種于改 良的Gordon湯中，45°C培養(yǎng)化產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離屯、后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除菌 后的A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素；
[0009]獲得上述外毒素之后，發(fā)明人利用LDso實(shí)驗(yàn)測定所產(chǎn)外毒素的活性。
[0010]除此之外利用其進(jìn)行了如下的具體應(yīng)用：
[0011] (1)甲醒滅活外毒素，得到類毒素，與弗氏佐劑乳化，作為免疫家兔的抗原；
[0012] (2)硫酸錠沉淀，再經(jīng)透析袋除鹽，Sephadex-G25柱層析對外毒素進(jìn)行除鹽純化濃 縮，作為間接化ISA的包被抗原；
[0013] (3)將粗提的毒素蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析鑒定毒素蛋白。
[0014] 2兔抗A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素高免血清的制備
[0015] 選取1.0-1.5Kg健康未接種過疫苗的家兔3只，將滅活的上述A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外 毒素和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，背部皮膚多點(diǎn)注射;首免7天和15天后，將滅活 的上述A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素和弗氏不完全佐劑按照體積1:1混合乳化，對家兔進(jìn)行二免 和Ξ免；Ξ免后10天撲殺家兔，無菌采血，自然凝固，離屯、取上清，所得高免血清作為間接 ELISA陽性對照血清；
[0016] 在獲得了上述兩個重要技術(shù)要素之后，發(fā)明人進(jìn)一步提供了間接化ISA檢測方法 如下：
[0017] (1)抗原包被:將濃縮純化的產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素用抗原包被液稀釋到化g/ml，每孔 1 (K)yL，加入到96孔酶標(biāo)板中，密封4 °C過夜；
[0018] (2)洗涂：將板中的液體垂直甩出，在干凈的吸水紙上拍干，至孔內(nèi)干燥無液體殘 留，每孔加入20化L PBST洗涂液，輕輕搖晃3min，再次甩出，拍干，加液時避免出現(xiàn)氣泡，重 復(fù)3次；
[0019] (3)封閉：洗涂完成后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200yL，4°C封閉過夜；
[0020] (4)洗涂:重復(fù)步驟2,洗涂好的板子放入4°C待用；
[0021] (5)加樣：用PBS將待檢樣品按照稀釋度1:100進(jìn)行稀釋，每孔l(K)yL，并設(shè)置陰性對 照，37 °C解育化；
[0022] (6)加二抗:重復(fù)步驟2后，用PBS稀釋皿P標(biāo)記的羊抗兔二抗，每孔1(Κ)化加到酶標(biāo) 板中，密封置于37°C解育化；
[0023] (7)顯色:洗涂酶標(biāo)板，每孔加入10化L TMB顯色液，于37°C溫箱內(nèi)避光放置15min;
[0024] (8)終止，讀數(shù):每孔加入10化L 2M硫酸終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取450nm處 的0D值；
[0025] 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0026] 計(jì)算陰性樣品的平均值? X j與標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，計(jì)算（繁）+3SD為陽性臨界值，運(yùn)用 建立的間接化ISA方法測定0D4日日皿，0〇4日血m大巧黎）巧SD為陽性，小巧?') +》織為陰性。
[0027] 在上述間接化ISA檢測方法中，所述的血平板培養(yǎng)基成分為：100ml去離子水、3.7g 豆粉瓊脂、Ig葡萄糖和5%體積比脫纖綿羊血；
[00%]所述改良的Gordon湯產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為：蛋白腺2g，糊精I(xiàn)g，酵母提取物2g，心精 氨酸1.2g，葡萄糖Ig，最后PBS定容至100ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)抑為7.5,高溫滅菌即得；
[0029] 所述的抗原包被液成分為：稱取Na2〇)3 0.795g、化肥化1.465g，加入400ml去離子 水中，定容至500ml，PH調(diào)至9.5;
[0030] 所述的PBS緩沖液成分為：1L去離子水、憐酸二氨鐘化出P〇4):0.27g、憐酸氨二鋼 (Na抽P〇4): 1.42g、氯化鋼(NaCl): 8g、氯化鐘化C1)0.2g;
[0031] 所述PBST洗涂液成分為:500化Tween-20溶解于IL的PBS中；
[0032] 所述封閉液成分為:5g脫脂奶粉溶于lOOmlPBST中；
[0033] 所述終止液（2M此S〇4)成分為:量取濃此S〇4 27.6ml加入到450ml去離子水中，混 勻后定容至1L。
[0034] 采用本發(fā)明上述公開的檢測方法，具有如下有益效果：
[0035] (1)特異性強(qiáng):本方法可檢測到A型產(chǎn)氣芙膜梭菌毒素抗體，對于抗β、ε毒素血清及 己氏桿菌病、沙口氏菌的血清抗體檢測結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性強(qiáng)。
[0036] (2)敏感性高:檢測結(jié)果顯示，當(dāng)陽性血清稀釋至1:12800時仍為陽性，表明該方法 敏感性很高。
[0037] (3)重復(fù)性好:本方法對陽性血清進(jìn)行多次重復(fù)檢測，結(jié)果均相一致。
【附圖說明】：
[0038] 圖1 A型產(chǎn)氣芙膜梭菌粗提外毒素蛋白SDS-PAGE電泳分析圖；
[0039] 圖中1、2、3泳道樣品在43KD處有產(chǎn)氣芙膜梭菌主要的外毒素(α毒素）的明顯條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0040] W下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。在實(shí)施例中設(shè)及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)等技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實(shí) 施例中所用的試劑及其來源：液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基購自青島海博生物；弗氏佐劑購自 sigma試劑公司;脫脂奶粉，ΤΜΒ顯色液購自索萊寶公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉 金橋;其他試劑所用化學(xué)試劑均為分析純。
[0041] 實(shí)施例1 A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素的制備：
[0042] A型產(chǎn)氣芙膜梭菌菌種(National Collection of Type Qiltures-英國微生物菌 種保藏中屯、保藏保藏號:NCT巧28)接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37°C厭氧培養(yǎng)36h，挑 取單個的菌落到硫乙醇酸鹽營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，在氣體濃度為88 %化、7 %此、5 % C〇2的 厭氧環(huán)境條件下38°C厭氧培養(yǎng)12h。將5mL A型產(chǎn)氣芙膜梭菌增菌液接種到100ml PH7.5的 產(chǎn)毒培養(yǎng)基中（每lOOmL PBS緩沖液溶解2g蛋白腺、Ig糊精、地酵母提取物和1.2旨心精氨酸， Ig葡萄糖）中，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，43°C培養(yǎng)化高效產(chǎn)毒，然后在4°C8000r/min離屯、 15min，再用孔徑0.22WI1的蔡氏濾器中過濾除菌，即得到除菌后的A型產(chǎn)氣芙膜梭菌的外毒 素。最終測得外毒素的LD50 = 24'25,即將外毒素稀釋19.03倍，腹腔注射1ml，能夠使半數(shù)小鼠 死亡。
[0043] 實(shí)施例2濃縮、純化包被抗原及其濃度的測定
[0044] 將除菌后的毒素溶液緩慢加入飽和硫酸錠溶液，最終使混合溶液中硫酸錠的體積 濃度達(dá)到50%，4°C靜置過夜；次日，將溶液8000r/min離屯、20min，棄掉上清，沉淀用適量 0.05M Tris-肥L緩沖液溶解，緩慢加入飽和硫酸錠溶液，使硫酸錠的最終濃度達(dá)到40%，重 復(fù)上述操作，最后將沉淀溶解于化is-H化中；接著用Se地adex-G25柱層析對外毒素進(jìn)行除 鹽純化濃縮;將純化后的毒素蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析蛋白純度，結(jié)果顯示分子量43KD處 有明顯條帶（如圖1所示），為主要致病外毒素 α毒素；用分光光度計(jì)測定26化m和280nm下的 吸光度值，確定毒素蛋白濃度為：（1.45 X A280 - 0.74 X A260) X稀釋倍數(shù)。
[0045] 實(shí)施例3免疫家兔，制備陽性血清
[0046] 將外毒素溶液中加入0.3%的甲醒，充分混勻后，37°C滅活96h，期間每隔5-化振蕩 搖晃一次。
[0047] 選取1.0-1.5Kg健康未接種過疫苗的家兔3只，將滅活的上述A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外 毒素和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，背部皮膚多點(diǎn)注射;首免7天和15天后，將滅活 的上述A型產(chǎn)氣芙膜梭菌外毒素和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，對家兔進(jìn)行二免和 Ξ免；Ξ免后10天撲殺家兔，無菌采血，自然凝固，離屯、取上清，所得高免血清作為間接 ELISA陽性對照血清。
[004引實(shí)施例4間接化ISA方法的建立
[0049] 通過方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定包被抗原的最佳濃度，確定檢測樣品、二抗的最佳的解育 條件，及其他間接化ISA的條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，最終確定如下體系：
[0050] (1)抗原及樣品最佳濃度、樣品最佳稀釋度確定
[0051 ]采用棋盤滴定法，用包被液將純化的毒素蛋白按照化g/ml、2μg/ml、：3μg/ml、4yg/ ml、5μg/ml、化g/ml 7μg/ml祉g/ml的濃度進(jìn)行稀釋，加入到96孔酶標(biāo)板橫排，每孔lOOyL包 被，4°C靜置過夜;洗涂后，脫脂奶粉封閉4°C過夜;次日洗涂，將制備的陽性血清用PBS稀釋 至1:20 1:40 1:80 1:100 1:200 1:400,加入到酶標(biāo)板的前6列，后六列按照同樣稀釋度加 入陰性血清，每孔10化L，密封后37 °C解育化;加二抗，顯色，終止反應(yīng);在450nm處用酶標(biāo)儀 讀取每孔的0D值，W陽性0D4日血m/陰性0D4日血m( P/N)值最大作為選擇抗原的最佳包被濃度和 樣品最佳稀釋度的依據(jù)。
[0052] 最終確定抗原蛋白最佳包被濃度為化g/ml，樣品最佳稀釋度為1:100。
[0053] (2)最佳封閉條件的選擇
[0054] 封閉液選擇5 %胎牛血清、5 %脫脂奶粉、1 % BSA，抗原包被濃度W 4μg/ml包被，按 上述方法進(jìn)行ELISA檢測，比較使用不同封閉液后的P/N值，P/N值最大選擇最佳封閉條件。
[0055] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5%胎牛血清與1%BSA封閉效果不如脫脂奶粉，因此選用效果較好， 價格適宜的5%脫脂奶粉。
[0056] (3)抗體最佳反應(yīng)時間的確定
[0057] 加入血清之后，分別在37Γ解育3〇111111、45111111、6〇111111，9〇111111按上述方法經(jīng)行檢測， 選擇最佳反應(yīng)時間
[0058] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體在37°C下解育60min檢測效果最好，P/N值最大，為最佳反應(yīng)時 間。
[0059] (4)酶標(biāo)二抗解育時間的確定
[0060] 根據(jù)試劑說明書，將酶標(biāo)二抗稀釋至1:10000，分別在37°(：解育30111111、45111111和 60min，90min比較出酶標(biāo)二抗最佳解育時間。
[0061] 多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二抗解育條件為37°C作用60min。
[0062] (5)顯色底物作用時間的選擇
[0063] 加入底物后，分別在37°C避光顯色5min、10min和15min，20min比較出顯色時間。
[0064] 多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示最佳顯色時間為15min。
[0065] (6)通過W上對間接化ISA各重要影響條件的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如下：
[0066] ①用抗原包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，P朋.6)將純化的抗原稀釋至化g/mL，100化/ 孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；
[0067] ②用PBST溶液（含0.05%Tween-20的PBS溶液:化化 8g/L、K化 0.2g/L、Na2HP〇4 · 12此0 3.58g/L、K此P〇4 0.27g/L，pH 7.4)洗涂3次，加入含5%脫脂奶粉的？85巧容液作為封 閉液20化L/孔，4 °C封閉過夜；
[0068] ③用PBST洗涂液洗涂3次W后，將待檢樣品用PBS稀釋至1:100,每孔10化L，密封后 37 °C解育化；
[0069] ④用PBST洗涂液洗涂3次W后，用PBS稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，稀釋至1:10000， 每孔10化L加到酶標(biāo)板中，密封置于37°C解育化；
[0070] ⑤洗涂酶標(biāo)板，每孔加入10化1 TMB顯色液，于37°C溫箱內(nèi)避光放置15min;
[0071] ⑥每孔加入10化1 2M的硫酸終止液，終止反應(yīng)；
[0072] ⑦酶標(biāo)儀測定450nm處每孔的0D值；
[0073] (7)判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0074] 運(yùn)用該方法檢測30份陰性血清，求取平均值（X )為0.236,標(biāo)準(zhǔn)差（SD)為0.015,， 可求出·χ·+330為0.281，'·χ'+230為0.266,即當(dāng)檢測數(shù)值大于0.281時，判定結(jié)果為陽性；當(dāng) 檢測數(shù)值小于0.266時，判定結(jié)果為陰性。
[00巧]實(shí)施例5間接化ISA檢測方法的性能評價
[0076] (1)特異性實(shí)驗(yàn):運(yùn)用建立好的間接化ISA方法，檢測免疫家兔制備的血清，同時檢 測陰性對照、替代試驗(yàn)組及感染己氏桿菌、沙口氏菌和球蟲等其他病原致死兔的血清。結(jié)果 顯示除了制備的血清為陽性外，其他檢測結(jié)果均為陰性，表明該檢測方法無交叉反應(yīng)，特異 性強(qiáng)。
[0077] (2)敏感性實(shí)驗(yàn):將制備的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清倍比稀釋（1:100 1:200 1:400 1:800 1: 1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600)用間接化ISA方法檢測，結(jié)果表明，當(dāng)血清稀釋至 1:25600時仍為陽性，表明該方法的敏感性高。
[0078] (3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):本方法對標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性對照進(jìn)行3次重復(fù)檢測，其重復(fù)結(jié)果 顯示相一致。
[0079] 實(shí)施例6運(yùn)用間接化ISA法對臨床樣品進(jìn)行檢測
[0080] 運(yùn)用建立好的間接化ISA方法對來自山東泰安某兔場內(nèi)100份血清進(jìn)行檢測，用間 接血凝試驗(yàn)作對照。該兔場已經(jīng)對家兔免疫過A型魏氏梭菌類毒素疫苗，免后一個月，進(jìn)行 隨機(jī)取樣，采集100只家兔的血液，分離血清后，按照間接化ISA的方法對血清樣品進(jìn)行檢 巧。。檢測結(jié)果顯示：間接血凝試驗(yàn)檢測92只家兔的血清樣品檢測為陽性，8只為陰性，陽性率 為92 % ;間接化ISA法檢測到100只家兔的血清樣品為陽性，陽性率為100 % ;說明該方法的 相較與其他方法的檢測陽性率高，具有良好的敏感性，為臨床易感動物A型產(chǎn)氣芙膜梭菌病 免疫預(yù)防提供了敏感、簡便的抗體檢測的方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接ELI SA檢測方法，其特征在于:含有步驟如下： (1 )A型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原的制備： A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37°C厭氧培養(yǎng)36h，選取單個 的菌落接種液體硫乙醇培養(yǎng)基增菌12小時，然后將增菌液按體積百分比5 %接種于改良的 Gordon湯中，45°C培養(yǎng)5h產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離心后用0.22Um蔡氏濾器過濾除菌，得到除菌后的 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素； (2)兔抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素高免血清的制備 選取1.0-1.5Kg健康未接種過疫苗的家兔3只，將滅活的上述A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素 和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，背部皮膚多點(diǎn)注射;首免7天和15天后，將滅活的上 述A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，對家兔進(jìn)行二免和三 免;三免后10天撲殺家兔，無菌采血，自然凝固，離心取上清，所得高免血清作為間接ELISA 陽性對照血清。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接ELISA 檢測方法，具體步驟為： (1) 抗原包被:將濃縮的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素用抗原包被液稀釋到4μg/ml，每孔100yL， 加入到96孔酶標(biāo)板中，密封4 °C過夜； (2) 洗滌:將板中的液體垂直甩出，在干凈的吸水紙上拍干，至孔內(nèi)干燥無液體殘留，每 孔加入200yL PBST洗滌液，輕輕搖晃3min，再次甩出，拍干，加液時避免出現(xiàn)氣泡，重復(fù)3次； (3) 封閉:洗滌完成后加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200yL，4°C封閉過夜； (4) 洗滌:重復(fù)步驟2，洗滌好的板子放入4 °C待用； (5) 加樣:用PBS將待檢樣品按照稀釋度1:100進(jìn)行稀釋，每孔100yL，37°C孵育lh; (6) 加二抗:重復(fù)步驟(2)，用ros稀釋HRP標(biāo)記的二抗，每孔100yL加到酶標(biāo)板中，密封置 于 37°Clh; (7) 顯色:洗滌酶標(biāo)板，每孔加入100yL TMB顯色液，于37°C溫箱內(nèi)避光放置15min; (8) 終止，讀數(shù):每孔加入100yL 2M硫酸終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取450nm處的0D 值。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述改良的Gordon湯配方為:蛋白胨2g，糊精 lg，酵母提取物2g，1-精氨酸1.2，葡萄糖lg，最后用PBS定容至100ml，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為 7.5,高溫滅菌即得。
【文檔編號】G01N33/543GK106066398SQ201610355768
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月25日 公開號201610355768.X, CN 106066398 A, CN 106066398A, CN 201610355768, CN-A-106066398, CN106066398 A, CN106066398A, CN201610355768, CN201610355768.X
【發(fā)明人】王海榮, 林曉佳, 柴同杰, 陳長俊
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)