專利名稱：產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒及其使用方 法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎最常見的病原之一，可引起典 型的食物中毒。美國(guó)疾病控制中心，估計(jì)每年因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬(wàn)人。 產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境中，易于形成芽胞。該細(xì)菌的芽胞長(zhǎng)期存在于土壤和沉淀物 中，芽胞的熱抵抗力很強(qiáng)。該菌也經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)在人和動(dòng)物的腸道中存在。從牛肉、豬肉、羔 羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜，燉肉和肉汁中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌，引起食物中毒的食品大 多是畜禽肉類和魚類食物，牛奶也可因污染而引起中毒。此外不少熟食品，由于加溫不夠或 后污染而在緩慢的冷卻過程中，細(xì)菌繁殖體大量繁殖并形成芽胞產(chǎn)生腸毒素，其食品并不 一定在色味上發(fā)現(xiàn)明顯的變化，人們?cè)谡`食了這樣的熟肉或湯菜，就有可能發(fā)病。雖然傳統(tǒng)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)方法是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4 7天才能 完成。由于其檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求。 因此，在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在 一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染 和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real timePCR)技術(shù)雖然較 好地解決了交叉污染的問題，并簡(jiǎn)化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，因此 不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較 高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定 性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技 術(shù)發(fā)展的最新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫?cái)U(kuò)增 (IsothermalAmplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè)技術(shù)上的長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)已 建立起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。因此，需要一種檢測(cè)效果更全面、特異性高、漏檢率低的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒 及其使用方法以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測(cè)效果更全面、特異性 高、漏檢率低的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，所述 的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒包括以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo) 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。16S rDNA是編碼原核生 物核糖體小亞基rRNA(16SrRNA)的基因。長(zhǎng)度約為1500bp，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、
5最有用的“分子鐘”，其序列包含10個(gè)可變區(qū)(variable region)和與之相同的11個(gè)恒定 區(qū)(constant region)，可變區(qū)因細(xì)菌而異，且變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)；較之 23SrDNA等看家基因而異，它具有分子大小適中，突變率小等優(yōu)點(diǎn)，素有“細(xì)菌化石”之稱。 Woese與Olsen基于對(duì)16SrDNA的分析構(gòu)建了現(xiàn)已被分認(rèn)的全生命系統(tǒng)進(jìn)化樹，越來(lái)越多的 細(xì)菌依據(jù)16SrDNA被正確分類或重分類，尤其是許多環(huán)境中的細(xì)菌。同時(shí)，16S rDNA也被廣 泛應(yīng)用于各類生物的核酸檢測(cè)中。對(duì)nt庫(kù)(所有已經(jīng)測(cè)序的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行BLAST搜索，除產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens)外，無(wú)其它高同源性序列。故假陽(yáng)性可能性極低，該序列適合 作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的靶標(biāo)序列。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩對(duì)引物為外引物F3(l) (SEQ ID NO 1)
AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA內(nèi)引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA內(nèi)引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA內(nèi)引物 FIP (2) (SEQ ID NO 5)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA內(nèi)引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(3) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT內(nèi)引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA內(nèi)引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT或外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA
外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT內(nèi)引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA內(nèi)引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè) 試劑盒還包括Bst DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、甜菜堿、硫酸鎂、顯色液、穩(wěn)定液和陽(yáng)性對(duì)照。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的BstDNA聚合酶 酶濃度7-IOU/ μ L ；所述的緩沖液含0·18-0. 25mol/L Tris-HCl，0· 10-0. 15mol/L KCl， 0.07-0. 15mol/L (NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2% TritonX-IOO ；所述的dNTPs 每種核苷酸濃度10-20mmol/L ；所述的甜菜堿濃度3-6mol/L ；所述的硫酸鎂濃度100-200mmol/L ；所述的顯色液為SYBR Green I 或 Eva Green ；所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽(yáng)性對(duì)照為產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的最優(yōu)選實(shí)施方式，所述的Bst DNA聚合酶 酶濃度8U/ μ L ；所述的緩沖液含0.2mol/LTris-HCl，0. lmol/L KCl，0. lmol/L(NH4)2SO4, 20mmol/L MgSO4,1% TritonX-100 ；所述的dNTPs 每種核苷酸濃度10mmol/L ；所述的甜菜堿濃度5mol/L ；所述的硫酸鎂濃度150mmol/L。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè) 試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其 分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。作為本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的A、B兩個(gè)空腔中 分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為緩沖液、 dNTPs、甜菜堿、硫酸鎂、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)方式，其擴(kuò)增效 率超強(qiáng)，表現(xiàn)在兩個(gè)方面(1)靈敏度比PCR高出的是數(shù)量級(jí)的差異；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA數(shù) 量，也比PCR產(chǎn)物高出太多，能夠達(dá)到幾個(gè)μ g，但過于靈敏和產(chǎn)物量的巨大，使得LAMP極易 容易污染，尤其是在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后需要反應(yīng)管開蓋加入顯色劑，容易出現(xiàn)氣溶膠污染。 而氣溶膠污染會(huì)使得檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率高，并且污染其他樣品，污染檢測(cè)區(qū)域，同時(shí)還難以 去除。本發(fā)明的反應(yīng)管通過隔板和穩(wěn)定液的設(shè)計(jì)，有效地將顯色液和工作液分隔開來(lái)，不僅 能保證在儲(chǔ)運(yùn)過程中相對(duì)保持完整封閉性，而且無(wú)需打開管蓋，就可以實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)，大大 降低氣溶膠的污染。
本發(fā)明還提供一種使用產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法，該方法包括如下步驟(1)將待測(cè)樣品增菌，得到樣品增菌液；(2)將樣品增菌液提取樣品模板DNA ；(3)在反應(yīng)容器中加入Bst DNA聚合酶1.8 2. 4體積份數(shù)、緩沖液10體積份數(shù)、 dNTPs15 20體積分?jǐn)?shù)、甜菜堿15 20體積分?jǐn)?shù)、硫酸鎂15 20體積分?jǐn)?shù)、穩(wěn)定液25 35體積份數(shù)、樣品模板DNA 10體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4 體積分?jǐn)?shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽(yáng)性對(duì)照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對(duì)照組相 同則為陽(yáng)性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16SrDNA 基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物。作為本發(fā)明使用產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩對(duì)引 物可以為外引物F3(l) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) :(SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA內(nèi)引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA內(nèi)引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA內(nèi)引物 FIP (2) (SEQ ID NO 5)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA內(nèi)引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(3) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT內(nèi)引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA內(nèi)引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT
或外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT內(nèi)引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA內(nèi)引物 BIP(4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。作為本發(fā)明使用產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中， 恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。本發(fā)明所說(shuō)的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)快速檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和 根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性 識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果 在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖_環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng) 過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂 乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C )條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化，克服了傳 統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員 的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本 低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò) 增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特 異性和檢測(cè)范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，而且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中以 微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒 定需2 3天，完成鑒定報(bào)告需10 15天；采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒僅需2小時(shí)。并且， 本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒只需一個(gè)恒 定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試 劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高 特異性；3.本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高； 4.本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷 試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—— 焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證 率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的16S rDNA基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物，使得 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的準(zhǔn)確率更高；7.在本發(fā)明檢測(cè)試劑盒中采用特 制的反應(yīng)管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時(shí)方便操作。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。下列縮略語(yǔ)適用于本發(fā)明LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid，Zi二月安0 !DNA deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸Betaine 甜菜堿Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚實(shí)施例1試劑盒的制備(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA內(nèi)引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA內(nèi)引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG。(2)購(gòu)置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制緩沖液緩沖液按 0. 18mol/L Tris_HCl，0. 10mol/L KCl，0. 07mol/ L(NH4)2SO4,15mmol/L MgSO4,1 體積％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每種核苷酸濃度按lOmmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜堿甜菜堿濃度按3mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸鎂溶液硫酸鎂濃度按lOOmmol/L配制，置于容器；(7)購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(8)購(gòu)置顯色液SYBR Green I，置于容器；(9)提取陽(yáng)性對(duì)照提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA，置于容器；(10)將上述9個(gè)容器裝成試劑盒，封裝；制備工藝簡(jiǎn)述如下1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì) 檢；2、將反應(yīng)液[即上述(2)_(6)步驟配制的液體]無(wú)菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃 度確定，抽樣質(zhì)檢；3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物 F3(2) :(SEQ ID NO 1) AACCTTCATCACTCACGCG
外引物 B3(2) :(SEQ ID NO 2)
GCAATCCGCTATGAGATGGA
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 5)
TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 6)
CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG。
(2)購(gòu)置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；
(3)配制緩沖液緩沖液按0. 25mol/L Tris-HCl，0. 15mol/L KCl，0. 15mol/ 2S04,30mmol/L MgSO4, 2 體積％ TritonX-100 配制，置于容器；
(4)配制dNTPs每種核苷酸濃度按20mmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜堿甜菜堿濃度按6mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸鎂溶液硫酸鎂濃度按200mmol/L配制，置于容器；
(7)購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(8)購(gòu)置顯色液EvaGreen，置于容器；
(9)提取陽(yáng)性對(duì)照提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA，置于容器；
(10)將上述9個(gè)容器裝成試劑盒，封裝； 其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例3試劑盒的制備
(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物 F3(3) :(SEQ ID NO 7) GGGGTAACGGCCTACCAA
外引物 B3(3) :(SEQ ID NO 8)
CCTCCTTGGGTACCGTCATT
內(nèi)引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA
內(nèi)引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
(2)購(gòu)置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；
(3)配制緩沖液緩沖液按0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KCl，0. Imo 1/ 2S04,20mmol/L MgSO4,1 體積％ TritonX-100 配制，置于容器；
(4)配制dNTPs每種核苷酸濃度按lOmmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜堿甜菜堿濃度按5mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸鎂溶液硫酸鎂濃度按150mmol/L配制，置于容器；
(7)購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(8)購(gòu)置顯色液EvaGreen，置于容器；
(9)提取陽(yáng)性對(duì)照提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA，置于容器；
(10)將上述9個(gè)容器裝成試劑盒，封裝；其他條件與實(shí)施例1相同。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，可以針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因，根據(jù)LAMP技 術(shù)的引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)得到其他的引物，例如外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT內(nèi)引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA內(nèi)引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。上述引物對(duì)均能達(dá)到本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果。實(shí)施例4產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用本方法的主要技術(shù)要點(diǎn)是1)樣品的制備和選擇性增菌依據(jù)GB/T 4789. 13《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜 梭菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行樣品制備和選擇性增菌。2)提取增菌液模板DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后進(jìn)行快速篩選。3)陰性結(jié)果可以直接出報(bào)告，陽(yáng)性結(jié)果采用傳統(tǒng)方法分離鑒定后確認(rèn)。本發(fā)明建立體系如下表示表1產(chǎn)氣莢膜梭菌菌LAMP反應(yīng)體系
組分工作液濃度加樣量μ 反應(yīng)體系終濃度ThermoPol緩沖液IOx2.5Ix外引物1 (F3)10 μπιοΙ/L0.50.2 μπιοΙ/L外引物2 (B3)10 μπιοΙ/L0.50.2 μηιοΙ/L內(nèi)引物1 (FIP)40 μπιοΙ/L1.01.6 μπιοΙ/L內(nèi)引物2 (BIP)40 μιηοΙ/L1.01.6 μπιοΙ/LdNTPs10 mmol/L41.6 mmol/L甜菜堿5 mol/L40.8 mol/LMgSO4150 mmol/L18 mmol/LBst DNA聚合酶8 U^L0.50.16 U/μ DNA模板/2.5/去離子水/7.5/1.1特異性特異性試驗(yàn)采用菌株來(lái)自各檢驗(yàn)檢疫局并經(jīng)過GB方法確認(rèn)。
12 1. 1. 1對(duì)上述菌株按照GB/T 4789. 13標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)獲得菌液，采用本發(fā)明方 法進(jìn)行LAMP檢測(cè)1)提取細(xì)菌DNA模板a)取增菌培養(yǎng)液1. 5ml于2ml離心管，IOOOOrpm,離心2min，去上請(qǐng)；b)加入Iml TE洗滌菌體一次，IOOOOrpm,離心2min，去上請(qǐng)；c)加入500 μ L TE (ρΗ8. 0)充分振蕩，重懸菌體；d)往管中加入10 15 μ L溶菌酶溶液(50mg/ml，20000U/mg)至終濃度lmg/ml， 混勻，37°C，反應(yīng)2 3h，并每IOmin振蕩一次；e)再加入1(^1^蛋白酶1((2011^/1111)，混勻，371，反應(yīng)111;f)接著加入52 μ L 10% SDS至終濃度1 %，混勻，37°C，溫浴30min ；g)加入 100 μ L 5Μ NaCl，80 μ L CTAB/NaCl，混勻，65°C，溫浴 IOmin ；h)加入等體積(約750 μ L)氯仿/異戊醇(24 1)，充分混勻，12000rmp,離心 5min ；i)小心移取上清至新的無(wú)菌2ml離心管中，加入等體積(約650yL)酚/氯仿/ 異戊醇(25 24 1)，充分混勻，12000rmp，離心5min ；j)小心移取上清液至另一新的無(wú)菌2ml離心管中，加入1/10體積的3MNa0Ac (pH6. 0)以及2倍體積(Iml)的冰凍無(wú)水乙醇，混勻，觀察是否有絮狀沉淀，-20°C 放置30min或者更長(zhǎng)時(shí)間；k) 12000rmp，4°C離心，lOmin，去上清；1)加入冰凍70%乙醇洗滌沉淀，12000rmp，4°C離心，lOmin，去上清；m)沉淀置通風(fēng)廚處風(fēng)干(約30min)，加入200 μ L TE (ρΗ8. 0)溶解沉淀；η)加入 20g RNase A，37°C，反應(yīng) 30min ；ο)再加入 400 μ L TE (ρΗ8. 0)和等體積(600 μ L)酚/ 氯仿 /異戊醇(25 24 1)， 充分混勻，12000rmp,離心5min ；ρ)小心移取上清至新的無(wú)菌2ml離心管中，加入1/10體積的3M NaOAc (ρΗ6. 0)和 2倍體積(Iml)的冰凍無(wú)水乙醇，混勻，-20°C放置30min或者更長(zhǎng)時(shí)間；q) 12000rmp，4°C 離心，lOmin，去上清；r)加入冰凍70%乙醇洗滌沉淀，12000rmp，4°C離心，lOmin，去上清；s)沉淀置通風(fēng)廚處風(fēng)干后，加入適量ΤΕ(ρΗ8. 0)或者無(wú)菌水溶解，可立即使用。2)按研制的體系配制反應(yīng)液，對(duì)上述模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，判斷引物特異性。反應(yīng)管中加入22 μ L的反應(yīng)液+0. 5 μ L的DNA聚合酶+30 μ L的穩(wěn)定液+2. 5 μ L待 檢模板；65°C環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)60min ；往反應(yīng)管中加入2 μ L顯色液，封管后輕輕搖勻觀察， 反應(yīng)管液體呈綠色，為產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性，呈橙色則為陰性。所述的反應(yīng)液為反應(yīng)體系中的 緩沖液、dNTPs、甜菜堿、硫酸鎂、水混合而成。產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，6株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株為陽(yáng)性。乙型溶 血性鏈球菌為陰性，副溶血弧菌為陰性，李斯特氏菌為陰性，金黃色葡萄球菌為陰性，志賀 氏菌為陰性，大腸桿菌為陰性，沙門氏菌為陰性。1.1.2干擾實(shí)驗(yàn)1)取產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCCl3124、沙門氏菌CCTCCAB94006、乙型溶血性鏈球 菌CMCC (B) 32210、副溶血弧菌ATCCl7802、李斯特氏菌CCTCCAB97021、金黃色葡萄球菌 CMCC (B) 26003、志賀氏菌51334-20、大腸桿菌CCTCCAB200068共八株菌，液體培養(yǎng)到OD6tltl為 0.4左右，此時(shí)菌液濃度大約為108CFU/mL，進(jìn)行10倍梯度逐倍稀釋到濃度為IO7-IO2CFU/
mLo2)準(zhǔn)備8個(gè)錐形瓶，每個(gè)盛有IOOmL肉湯培養(yǎng)基，8個(gè)瓶中接入終濃度分別為 (1) 102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+104CFU/mL沙門氏菌；⑵102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+IO4CFU/ mL乙型溶血性鏈球菌；(3) 102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+104CFU/mL副溶血弧菌；⑷IO2CFU/ mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+104CFU/mL李斯特氏菌；(5) 102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+104CFU/mL金黃色 葡萄球菌；(6) 102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌+104CFU/mL志賀氏菌；(7) 102CFU/mL產(chǎn)氣莢膜梭菌 +104CFU/mL大腸桿菌；(8)七種菌(沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌、副溶血弧菌、李斯特氏 菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和大腸桿菌)的混合菌液(每種菌終濃度均為103CFU/mL)。3)按研制的體系配制反應(yīng)液，對(duì)上述模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，判斷引物特異性。反應(yīng)管中加入22 μ L的反應(yīng)液+0. 5 μ L的DNA聚合酶+30 μ L的穩(wěn)定液+2. 5 μ L待 檢模板；65°C環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)60min ；往反應(yīng)管中加入2 μ L顯色液，封管后輕輕搖勻觀察， 反應(yīng)管液體呈綠色，為產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性，呈橙色則為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌分別與乙型溶血性鏈球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明本發(fā)明方法對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)具有良好的特異性與抗 干擾性。1. 2靈敏度取目標(biāo)菌菌液定量到約0. 4麥?zhǔn)蠞岫龋缓筮M(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得ICT1 10, 濃度的菌液；取其中的10_5 10_7濃度的菌液Iml按GB/T4789. 2進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(厭氧培 養(yǎng))，另取KT1 10,濃度的菌液用于本發(fā)明方法做提取核酸及檢測(cè)，比較等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果與 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果判斷靈敏度。步驟如下(1)取編號(hào)為ATCC13124菌液，用生理鹽水稀釋至約0. 4麥?zhǔn)蠞岫龋?2)取0. 5ml步驟1的稀釋菌液加入4. 5ml無(wú)菌生理鹽水中，混勻，獲得10_1菌 液，如此類推獲取KT1 10_1(1濃度的菌液；(3)取其中的10_5 10_7濃度的菌液Iml按GB/T4789. 2進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(厭氧培 養(yǎng))；(4)另取10—1 10,濃度的菌液按本發(fā)明方法步驟進(jìn)行提取及檢測(cè)；(5)比較等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果判斷靈敏度。
對(duì)10_4 10_6濃度的菌液按GB/T4789. 2做菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見下表。
15
綜合上述結(jié)果，在本次實(shí)驗(yàn)中判斷本發(fā)明方法靈敏度可達(dá)到1. 4X 104CFU/mL。實(shí)施例5實(shí)施例1的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒對(duì)人工模擬樣品的試驗(yàn)1樣品制備、增菌培養(yǎng)1)接種和培養(yǎng)取標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)菌株接入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)至600nm波長(zhǎng)處吸光度在0. 35-0. 45 之間，取菌液做10倍梯度稀釋，分別標(biāo)記為IiT1 10_1(1。2)菌落計(jì)數(shù)取25g(mL)食品，按GB/T 4789. 13方法進(jìn)行勻漿；分別取ImL不同稀釋度的菌液 進(jìn)行食品樣品人工污染。3)增菌按GB/T 4789. 13方法作增菌處理。增菌后按GB/T 4789. 2方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。2細(xì)菌模板DNA的制備(具體方法參照實(shí)施例4)3采用本發(fā)明實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行LAMP方法檢測(cè)1)反應(yīng)過程a)在反應(yīng)管中分別加入相應(yīng)反應(yīng)液22. 5 μ L、Bst酶0. 5 μ L，混勻，然后加入30 μ L 穩(wěn)定液，最后在管中加入2. 5 μ L上述核酸摸板；b)反應(yīng)管置65°C溫育60min ；2)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置以樣品預(yù)處理液代替DNA模板作為陰性對(duì)照；以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板作為陽(yáng)性對(duì)照。4結(jié)果觀察在反應(yīng)管中分別加入2 μ L顯色液后觀察結(jié)果；在陰性對(duì)照反應(yīng)管為橙色，陽(yáng)性對(duì) 照反應(yīng)管呈綠色的條件下待檢樣品反應(yīng)管呈綠色，則為陽(yáng)性；待檢樣品反應(yīng)管呈橙色，則可報(bào)告為陰性。若與上述條件不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，重新檢測(cè)。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用5類食品，每類食品分別以3種濃度水平接種進(jìn)行人工模擬。每個(gè)樣品重復(fù) 3次試驗(yàn)，確定結(jié)果。
在陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控正常的情況下，當(dāng)人工污染樣品的菌落計(jì)數(shù)為2000CFU/mL 時(shí)被檢出陽(yáng)性。實(shí)施例6實(shí)施例2的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒對(duì)自然樣品的試驗(yàn)抽取市場(chǎng)食品樣品180份，其中肉制品50份、水產(chǎn)品50份、調(diào)味品30份、乳制品 30及蛋制品20份，分別采用本發(fā)明實(shí)施例2的試劑盒、實(shí)施例5的方法及GB/T 4789. 13傳 統(tǒng)方法檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌。
本標(biāo)準(zhǔn)方法與GB/T 4789. 13傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果一致性較好。實(shí)施例7采用反應(yīng)管的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，采用的試劑和引物與實(shí)施例1相同，試劑 盒還包括反應(yīng)管，反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B 兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板，其中空腔A內(nèi)裝有22. 0 μ L的LAMP反應(yīng)液和0. 5 μ L的Bst DNA聚合酶，液體上層由石蠟封存；空腔B內(nèi)裝有2. 0 μ L的LAMP反應(yīng)顯色液，液體上層也 由石蠟封存，將該反應(yīng)管-20°C保存。本實(shí)施例采用反應(yīng)管作為容器，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性對(duì) 照組和陰性對(duì)照組，具體包括如下步驟取上述制備的反應(yīng)管三支，采用移液槍分別加入陰性對(duì)照樣品、待檢測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品各2. 5 μ L，加樣時(shí)槍頭穿透保護(hù)液層，樣品加至反應(yīng)管A腔內(nèi)，蓋緊管蓋并做好 標(biāo)記,移至反應(yīng)區(qū)。將上述反應(yīng)管均于65°C恒溫反應(yīng)Ih。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動(dòng)1次，再正置甩動(dòng)1次，使工作液與顯色液充分混合 均勻后觀察。若反應(yīng)管與陽(yáng)性對(duì)照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，若反應(yīng)管與陰性對(duì)照管一樣顯現(xiàn) 橙色則為陰性。在LAMP反應(yīng)過程中，顯色液與工作液密封狀態(tài)好，沒有發(fā)生互相泄露的情況，后 期顯色反應(yīng)時(shí)，倒置甩動(dòng)操作使得顯色液和工作液混合，顯色結(jié)果清晰。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
權(quán)利要求
一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒包括以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的兩對(duì)引物為 外引物F3⑴AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑴ GCAATCCGCTATGAGATGGA 內(nèi)引物FIP(I)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA 內(nèi)引物BIP(I)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3⑵ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑵ GCAATCCGCTATGAGATGGA 內(nèi)引物FIP (2)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA 內(nèi)引物BIP (2)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3(3) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(3) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 內(nèi)引物FIP (3)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA 內(nèi)引物BIP (3)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT 或外引物F3(4) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(4) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 內(nèi)引物FIP (4)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA 內(nèi)引物BIP (4)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的產(chǎn)氣莢膜梭 菌檢測(cè)試劑盒還包括BstDNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、甜菜堿、硫酸鎂、顯色液、穩(wěn)定液和陽(yáng) 性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶濃度7-10U/ μ L ；所述的緩沖液含0. 18-0. 25mol/L Tris_HCl，0. 10-0. 15mol/L KC1，0. 07-0. 15mol/ L(NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2 體積％ TritonX-100 ； 所述的dNTPs 每種核苷酸濃度10-20mmol/L ； 所述的甜菜堿濃度3-6mol/L ； 所述的硫酸鎂濃度100-200mmol/L ； 所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽(yáng)性對(duì)照為產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶濃度8U/ μ L ；所述的緩沖液含0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KC1，0. lmol/L (NH4) 2S04, 20mmol/L MgSO4,1 體積％ TritonX-100 ；所述的dNTPs 每種核苷酸濃度lOmmol/L ； 所述的甜菜堿濃度5mol/L ； 所述的硫酸鎂濃度150mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的產(chǎn)氣莢 膜梭菌檢測(cè)試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下 部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個(gè)空 腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為緩 沖液、dNTPs、甜菜堿、硫酸鎂、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。
8.一種使用如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于，該方 法包括如下步驟(1)將待測(cè)樣品增菌，得到樣品增菌液；(2)將樣品增菌液提取樣品模板DNA；(3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶1. 8 2. 4體積份數(shù)、緩沖液10體積份數(shù)、dNTPs 15 20體積分?jǐn)?shù)、甜菜堿15 20體積分?jǐn)?shù)、硫酸鎂15 20體積分?jǐn)?shù)、穩(wěn)定液25 35體 積份數(shù)、樣品模板DNA 10體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積 分?jǐn)?shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽(yáng)性對(duì)照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對(duì)照組相同則 為陽(yáng)性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16SrDNA基因 為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于，所述的3兩對(duì)引物為外引物F3⑴ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑴ GCAATCCGCTATGAGATGGA 內(nèi)引物FIP(I)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA 內(nèi)引物BIP(I)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3⑵ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑵ GCAATCCGCTATGAGATGGA 內(nèi)引物FIP (2)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA 內(nèi)引物BIP (2)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3(3) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(3) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 內(nèi)引物FIP (3)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA 內(nèi)引物BIP (3)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT 或外引物F3(4) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(4) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 內(nèi)引物FIP (4)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA 內(nèi)引物BIP (4)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的使用產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于， 步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒，所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒包括以產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因?yàn)榘谢颉⒒诃h(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)效果更全面、漏檢率低。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101892299SQ201010114229
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者馮家望, 尹斌, 曹以誠(chéng), 李丹琳, 杜正平, 柯佳佳, 田文武, 陳洵 申請(qǐng)人:廣州華峰生物科技有限公司