質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法，具體涉及以介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿對(duì)照品的共有產(chǎn)物離子為導(dǎo)向，通過(guò)引入LC?QTOF?MS/MS技術(shù)，建立了介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的快速表征方法，再借助LC?QQQ?MS/MS強(qiáng)大的篩選功能，從貝母屬藥材中篩選出了一系列環(huán)巴胺類(lèi)似物，然后采用自動(dòng)純化系統(tǒng)根據(jù)餾分的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行餾分的制備。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物的分離方法，公開(kāi)了一種質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)巴胺(Cyclopamine)是一種介藜蘆類(lèi)異留體類(lèi)生物堿，主要存在百合科植物伊貝母(Fritillaria pallidif1ra Schrenk)、加州藜蘆(Veratrum californicum)、毛葉藜蘆(Veratrum grandif 1rum)中。二十世紀(jì)60年代至80年代對(duì)環(huán)巴胺的研究?jī)H限于致畸作用，但90年代中期的研究表明，環(huán)巴胺是一種hedgehog信號(hào)通路抑制劑，由于hedgehog信號(hào)通路的突變與多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，因此環(huán)巴胺作為一種潛在的抗腫瘤新藥在世界范圍內(nèi)掀起了研究熱潮。近些年研究人員對(duì)環(huán)巴胺進(jìn)行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)它對(duì)髓母細(xì)胞癌、膽管癌、卵巢癌、胰腺癌均顯示出良好的抑制活性，并且美國(guó)Infinity制藥公司開(kāi)發(fā)的抗腫瘤藥物環(huán)巴胺衍生物IP1-926已在2012年完成Π期臨床試驗(yàn)。
[0003]由于環(huán)巴胺、介芬胺等異留體生物堿結(jié)構(gòu)特殊，其全合成步驟長(zhǎng)達(dá)20步總反應(yīng)得率也僅為 1% (Giannis ,A.,Heretsch, P., Sarli ,V., StiiPel ,A.,Angew.Chem.1nt.Ed.2009,48,7911-7914.)，所以目前主要是用苯等有機(jī)溶劑提取再經(jīng)柱層析、萃取除雜等步驟從加州藜蘆中提取環(huán)巴胺，然而環(huán)巴胺在植物中含量低微，不到萬(wàn)分之一，且常規(guī)提取分離操作繁瑣，得率較低，大量使用苯這種有毒試劑對(duì)環(huán)境、對(duì)研究人員也都有一定傷害，這在很大程度上限制了這一極具發(fā)展前景的抗腫瘤藥物的繼續(xù)深入研究。為提高產(chǎn)率，通常采用半合成的方式，先從植物中提取環(huán)巴胺類(lèi)似物再半合成得到環(huán)巴胺，然后對(duì)得到的環(huán)巴胺進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以期得到抗腫瘤活性較好的環(huán)巴胺衍生物。
[0004]貝母屬(Fritillaria)中最具代表性的環(huán)巴胺類(lèi)似物是貝母辛(peimisine)，幾乎每一種貝母都含有。目前從貝母屬分離到的環(huán)巴胺類(lèi)似物還包括:環(huán)巴胺(cyclopamine)、環(huán)坡素(eyeloposine)、伊貝辛(yibeissine)、貝母辛-3_0-0-0-葡萄糖苷(卩6；[11118；[116-3-0-β-D-glucopyranoside)等等，這些類(lèi)似物可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)或者去糖基化等反應(yīng)半合成環(huán)巴胺。雖然異留體生物堿在貝母屬中種類(lèi)繁多，但是對(duì)貝母屬植物中介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的研究還遠(yuǎn)未開(kāi)展。
[0005]在天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域，常規(guī)的“提取一分離一結(jié)構(gòu)鑒定”仍然是主流的研究模式，對(duì)不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型、不同含量分布的化合物缺乏與之相適應(yīng)的“個(gè)性化”的技術(shù)手段與研究路線，分離過(guò)程常因周期長(zhǎng)、缺乏導(dǎo)向性而導(dǎo)致具有重要生理活性和新穎骨架結(jié)構(gòu)類(lèi)型化合物發(fā)現(xiàn)的效率與幾率偏低。
[0006]針對(duì)這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外研究人員當(dāng)前的主要工作思路是:①開(kāi)發(fā)新型分離介質(zhì)以提高分離效率，如小粒子填料、微孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂等;②引入新的分離技術(shù)以適應(yīng)特殊分離任務(wù)，如分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)用于手性化合物的分離、疏水作用色譜(hydrophobic interact1n chromatography，HIC)用于強(qiáng)極性成分的分離等;③發(fā)展各種聯(lián)用技術(shù)，如高速逆流色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HSCCC-ELSD)、離心分配色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(CPC-ELSD)等聯(lián)用技術(shù)用于弱紫外吸收成分的制備分離。但是，如何增強(qiáng)分離過(guò)程的導(dǎo)向性和靈敏度，仍然沒(méi)有切實(shí)可行的解決方案。因此，突破新化合物發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)研究模式，建立新穎結(jié)構(gòu)類(lèi)型天然產(chǎn)物的高效、快速、靈敏的分離分析方法，以提高新天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的效率、靈敏度和資源利用效率，是現(xiàn)今天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域需要解決的重要科學(xué)問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)介藜蘆類(lèi)異留體生物堿在我國(guó)貝母屬藥用植物中“結(jié)構(gòu)多樣，含量低微”的分布特點(diǎn)，提出質(zhì)譜快速表征-目標(biāo)導(dǎo)向分離的研究方法。
[0008]本發(fā)明首先采用高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)環(huán)巴胺類(lèi)似物進(jìn)行質(zhì)譜表征，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律提出診斷離子;然后，根據(jù)診斷離子采用高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜(LC-QQQ-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)篩選貝母屬植物中的環(huán)巴胺類(lèi)似物;接著，采用LC-QTOF-MS/MS驗(yàn)證貝母屬中的環(huán)巴胺類(lèi)似物;最后，根據(jù)篩選結(jié)果，選擇資源量大、目標(biāo)生物堿含量較高或含有新穎結(jié)構(gòu)的品種，使用自動(dòng)純化系統(tǒng)導(dǎo)向分離環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0009]LC-QTOF-MS/MS可以通過(guò)四級(jí)桿質(zhì)譜(MSl)預(yù)篩出一個(gè)母離子(precursor 1n orparent 1n)，然后以全掃描的方式記錄產(chǎn)物離子(product 1n)的質(zhì)譜圖，用飛行時(shí)間質(zhì)譜(MS2)進(jìn)行檢測(cè)，母離子和產(chǎn)物離子均可獲得準(zhǔn)確分子量(質(zhì)量準(zhǔn)確度可小于2ppm，分辨率在10000以上)，可以用于天然產(chǎn)物中母離子和碎片離子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式推導(dǎo)。LC-QTOF-MS/MS集成液相色譜高分離效率、串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜高靈敏度、高分辨率的功能為一體，在復(fù)雜天然產(chǎn)物的成分鑒定中正發(fā)揮著重要作用。LC-QQQ-MS/MS的母離子掃描(precursor1n scan)模式中的第一個(gè)四級(jí)桿Ql測(cè)定母離子，第三個(gè)四級(jí)桿Q3測(cè)定某個(gè)或幾個(gè)特定的碎片離子，因此可以在非常復(fù)雜的混合物或藥材提取液中檢測(cè)到某種特定的分子。自動(dòng)純化系統(tǒng)以質(zhì)譜作為引導(dǎo)制備目標(biāo)化合物，抗干擾能力強(qiáng)，制備準(zhǔn)確性高，可以針對(duì)藥材中的目標(biāo)分子量進(jìn)行跟蹤制備，快速獲得目標(biāo)化合物。
[0010]該方法快速、精確、自動(dòng)化程度高、適用性強(qiáng)，適合于結(jié)構(gòu)特殊但豐度極低的天然產(chǎn)物的快速發(fā)現(xiàn)、目標(biāo)導(dǎo)向分離。
[0011]本發(fā)明包括以下內(nèi)容:
[0012](I)介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的質(zhì)譜表征:采用LC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿進(jìn)行質(zhì)譜表征，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律提出診斷離子。
[0013]在液相色譜參數(shù)和其他質(zhì)譜參數(shù)固定的前提下，在25?60V區(qū)間內(nèi)，以5V為間隔對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)比較不同介藜蘆類(lèi)異留體生物堿對(duì)照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和豐度變化，分子中不含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿最佳碰撞能量為35?45V，此時(shí)前體母離子已經(jīng)碎裂，特征子離子(如m/z 67.05 ,m/z 84.08 ,m/z 85.06 ,m/z 109.10 ,m/z114.09)的豐度達(dá)到最大；同樣地，含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿最佳碰撞能量為45?55V;另外，隨著碰撞能量的加大(50?60V或更大)，所有生物堿二級(jí)質(zhì)譜的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09轉(zhuǎn)移為m/z 67.05。綜合以上信息，選擇40V作為不含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的碰撞能量，50V作為含糖的介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的碰撞能量，在此電壓下，m/z
67.05,m/z 84.08,m/z 109.10,m/z 114.09的離子豐度百分比均在20%以上，并且基峰離子是m/z 109.10或m/z 114.09，將這四種離子作為介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的診斷碎片離子。
[0014](2)貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的化學(xué)篩選:采用LC-QQQ-MS/MS聯(lián)用技術(shù)篩選貝母屬植物中的環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0015]以5種介藜蘆類(lèi)異留體生物堿混合對(duì)照品溶液在ESI正離子模式下進(jìn)行裂解電壓、碰撞能量的優(yōu)化。使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，在100?180V區(qū)間內(nèi)，以20V為間隔對(duì)裂解電壓進(jìn)行優(yōu)化;使用子離子掃描(product 1n scan)模式，在40?60V區(qū)間內(nèi)，以5V為間隔對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。最終確定裂解電壓為120V，碰撞能量為45V。并對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，確定5種介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的準(zhǔn)分子離子分別為CAm/z 412.3、CS m/z 574.4、JV m/z426.3,PJV m/z 588.4和PS m/z 428.3。然后以上述離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，測(cè)得主要的子離子均為m/z 67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1和m/z114.1，且這6個(gè)子離子的豐度均在20%以上，其中m/z 67.05,m/z 109.1和m/z 114.1的豐度在50%以上。
[0016]在采用母離子掃描模式(precursor1n scan)掃描母離子時(shí)，軟件中設(shè)置的產(chǎn)物離子不能超過(guò)4個(gè)。以15種異留體生物堿對(duì)照品為對(duì)象優(yōu)化母離子掃描模式的參數(shù)，將豐度最高的m/z 67.05、m/z 109.1 和m/z 114.1固定為產(chǎn)物離子，再?gòu)膍/z 81.07、m/z 84.08和m/z 85.06中選擇I個(gè)最合適的產(chǎn)物離子。當(dāng)掃描路徑為m/z 67.05、m/z 109.1、m/z 114.1和m/z 84.08時(shí)，介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿全部被檢出，還掃描出一個(gè)藜蘆胺類(lèi)異甾體生物堿。QQQ-MS/MS在母離子掃描模式下，只要母離子的碎片中含有PreIS模式設(shè)置的子離子，無(wú)論豐度高低，檢測(cè)器都會(huì)采集到信號(hào)，所以會(huì)采集到假陽(yáng)性母離子。最終確定母離子掃描狀態(tài)下的4個(gè)產(chǎn)物離子參數(shù)為m/z 67.05、m/z84.08、m/zl09.10、m/zl 14.09。應(yīng)用母離子掃描模式對(duì)不同品種不同批次的貝母屬藥材進(jìn)行分析檢測(cè)，可以得到一系列可能的環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0017](3)環(huán)巴胺類(lèi)似物的驗(yàn)證:采用LC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)驗(yàn)證貝母屬中存在的環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0018]借助QTOF Auto MS/MS模式去除QQQ-MS/MS母離子掃描模式假陽(yáng)性母離子。將QQQ-MS/MS掃描出來(lái)的母離子設(shè)為需要被“preferred”離子，樣品碰撞能量設(shè)定為40V和50V(分子量在500Da以下的碰撞電壓為40V，分子量在500Da以上的碰撞電壓為40V和50V)。根據(jù)QTOF Auto MS/MS模式的掃描結(jié)果進(jìn)行篩選，當(dāng)化合物滿足m/z 67.05,m/z 84.08,m/z109.10和m/z 114.09這4個(gè)離子峰的豐度均在20%以上并且m/z 109.10或者m/z 114.09為基峰(分子量大于500Da的化合物以50V時(shí)為準(zhǔn))時(shí)可以確定為環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0019](4)根據(jù)篩選結(jié)果，選取資源量大、介藜蘆類(lèi)異留體生物堿含量相對(duì)較高或含有新穎結(jié)構(gòu)的貝母用自動(dòng)純化系統(tǒng)分離制備環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0020]收集方法的設(shè)置:根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)觸發(fā)收集。首先采集一針總生物堿的色譜圖，使目標(biāo)化合物與周?chē)s質(zhì)有盡量好的分離度，根據(jù)目標(biāo)化合物m/z 460.4的提取色譜圖確定目標(biāo)化合物的起始收集位置，以該位置的質(zhì)譜響應(yīng)響度作為收集方法中質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度閾值。
[0021]以常規(guī)的含鹽體系0.1%甲酸和1mM甲酸銨溶液(A)-乙腈溶液(B)作為流動(dòng)相分離制備時(shí)，色譜圖重復(fù)性不好、背景高。經(jīng)優(yōu)化后，確定分離目標(biāo)生物堿m/z460.4的液相條件為:色譜柱為Waters SunFire? Prep C180BD(9 X 250mm, 5μηι);流動(dòng)相:0.I % 甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B);等度洗脫:0?45min，9%B;流速:10ml/min。當(dāng)流動(dòng)相流速為10ml/min時(shí)，相應(yīng)的延遲時(shí)間設(shè)置為17s。在進(jìn)樣量約為50mg的貝母總生物堿的質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物m/z 460.4在兩個(gè)位置出峰，出峰時(shí)間段分別為12.4-13.4min、33.0-35.0min，對(duì)兩處目標(biāo)化合物分別進(jìn)行收集得到目標(biāo)化合物饋分。
[0022]其中貝母總生物堿的制備方法如下:
[0023]將貝母藥材干燥的鱗莖粉碎，過(guò)20目篩。取約400g粗粉，提取按固液比1:8的比例用95%乙醇在70°C回流提取2h，連續(xù)提取3次。合并3次提取液，濾過(guò)，減壓蒸干溶劑。殘?jiān)?.lmol/L鹽酸溶解，濾過(guò)。濾液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水層，用10%氫氧化鈉調(diào)pH至9?10。用二氯甲烷萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，減壓蒸干溶劑，供自動(dòng)純化系統(tǒng)上樣用。
[0024]本發(fā)明以具有抗腫瘤活性的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿為目標(biāo)，針對(duì)其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)以及含量低微的特點(diǎn)，以介藜蘆類(lèi)異留體生物堿對(duì)照品的共有產(chǎn)物離子為導(dǎo)向，通過(guò)引入LC-QTOF-MS/MS技術(shù)，充分發(fā)揮了其在復(fù)雜體系中的高分離效率、高靈敏度、高分辨率的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的快速表征方法，再借助LC-QQQ-MS/MS強(qiáng)大的篩選功能，從貝母屬藥材中篩選出了一系列環(huán)巴胺類(lèi)似物，然后采用自動(dòng)純化系統(tǒng)根據(jù)餾分的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行餾分的制備。該方法快速、精確、自動(dòng)化程度高、產(chǎn)品純度好，尤其適合于結(jié)構(gòu)特殊但豐度極低的天然產(chǎn)物的快速發(fā)現(xiàn)、目標(biāo)導(dǎo)向分離。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的二級(jí)質(zhì)譜圖(碰撞能量=40V)
[0026]圖2是貝母藥材LC-QQQ-MS/MS母離子模式掃描圖譜
[0027]圖3是自動(dòng)純化系統(tǒng)分離平貝母總生物堿的色譜圖
[0028]圖4是自動(dòng)純化系統(tǒng)二次分離平貝母中m/z460.4(A)的色譜圖
[0029]圖5是自動(dòng)純化系統(tǒng)二次分離平貝母中m/z460.4(B)的色譜圖
[0030]圖6是自動(dòng)純化系統(tǒng)分離平貝母總生物堿的色譜圖
[0031 ]圖1 中的解釋:(A)cyclopamine，(B) jervine，(C)peimisine，(D)cycloposine，(E)pseudojervine
[0032]圖2中的解釋:(厶郵，如1^，(0幾(0從2，$卿，$)冊(cè)，(6師，(!0冊(cè)，(1如，(了)YL,(K)ZBj(L)WANBEI
[0033]圖3中的解釋:(A)m/z460.4的提取離子色譜圖(B)總生物堿的總離子流圖
[0034]圖4中的解釋:(A)m/z460.4(A)的提取離子色譜圖(B)m/z460.4(A)的總離子流圖
[0035]圖5中的解釋:(A)m/z460.4(B)的提取離子色譜圖(B)m/z460.4(B)的總離子流圖
[0036]圖6中的解釋:(A)m/z428.4的提取離子色譜圖(B)總生物堿的總離子流圖
[0037]實(shí)施例1
[0038]丨.實(shí)驗(yàn)部分
[0039]1.1試劑與材料
[0040]試劑:色譜純乙腈和色譜純甲醇(Merck，德國(guó))，色譜純甲酸(純度99 %，ROC，美國(guó))，分析純甲酸銨(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)上海)。雙蒸水(18ΜΩ.cm-O由Mi I I1-Q純水儀制。
[0041]對(duì)照品:15個(gè)異留體類(lèi)生物堿，包括5個(gè)介藜蘆胺類(lèi)異留體生物堿(jervine-typeisosteroidal alkaloids):cyclopamine(CA)、jervine(JV)、peimisine(PS)、cycloposine(CS)和pseudo jervine (PJV) ； 5個(gè)瑟文類(lèi)異留體生物喊(cevanine-type isosteroidalalkaloids):puqiedine、puqiedinone、hupehenine、verticine和verticinone ； 5個(gè)藜蘆胺
veratramine-type isosteroidal alkaloids): veratrosine(VS)、puqienine A、puqienine B、puqienine C^Ppuqienine D0
[0042]實(shí)驗(yàn)材料:MCX小柱(Waters OasisO，混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱)
[0043]藥材:12種不同貝母的鱗莖，包括太白貝母(TB)，暗紫貝母(AZ)，梭砂貝母(LB)，甘肅貝母(GS)，卷葉貝母(JY)，瓦布貝母(WB)，浙貝母(ZB)，湖北貝母(HB)，伊犁貝母(YL)Jjf疆貝母(XJ)，平貝母(PB)，皖貝母(WANBEI)
[0044]1.2分析儀器和檢測(cè)條件
[0045]LC-QTOF-MS/MS質(zhì)譜表征:色譜分析采用安捷倫I 200液相系統(tǒng)(Agi lent，Germany)，含在線真空脫氣機(jī)、高壓二元栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。色譜分離采用AglientZorbax SB C18柱(4.6 X 150mm，5μπι)；柱溫:30°C；流動(dòng)相:0.I % 甲酸和1mM甲酸銨溶液(A)-乙腈溶液(B);梯度洗脫程序:0?10min，15%?25%B;10?32min，25%?30%B;32?3711^11，30%?50%8;37?4211^11，50%?60%8;42?4511^11，60%?100%8;柱后運(yùn)行時(shí)間15!11；[11回到起始梯度;流速:1.01111/111；[11。進(jìn)樣體積:]^1。檢測(cè)器采用48；[161^ 6530QT0F/MS系統(tǒng)(Agilent Corp,USA)，電噴霧(ESI)離子源。
[0046]質(zhì)譜檢測(cè)條件為:干燥氣體溫度，325°C ;干燥氣流速，5.0L/min;霧化氣(nebulizer)，45psig;鞘氣溫度(sheath gas temperature),350°C ;鞘氣流速，10L/min;毛細(xì)管電壓，4000V;錐孔電壓(skimmer)，65V;0CT IRF Vpp，750V;裂解電壓(fragmentorvoltage)，120V。正離子模式為全程監(jiān)測(cè)模式，一級(jí)離子掃描范圍設(shè)置為m/z 100?1000，二級(jí)離子掃描范圍設(shè)置為m/z 50?1000。數(shù)據(jù)采集模式:Target MS/MS，待測(cè)成分的[M+H]+離子選做母離子用于獲取碎片離子。
[0047]數(shù)據(jù)米集及處理分別米用AgilentLC-MS-QTOF Mass Hunter Acquisit1nSoftware Vers1n.A.01.0OAgilent Technologies)及Mass Hunter Workstat1nSoftware Vers1n B.02.00(Agilent Technologies)分析軟件。
[0048]LC-QQQ-MS/MS:液相色譜分析采用安捷倫1290液相系統(tǒng)(Agilent ,Germany)，含在線真空脫氣機(jī)、高壓二元栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。色譜柱和色譜條件同LC-QTOF-MS/MS部分。流速:1.0ml/min，柱后分流使50 %的洗脫液流入QQQ-MS進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)樣體積:5μ1。
[0049]檢測(cè)器采用Agilent6460QQQ/MS€#(Agilent Corp，USA)，電噴霧(ESI)離子源。質(zhì)譜檢測(cè)條件為:干燥氣體溫度，325°C ;干燥氣流速，5.0L/min;霧化氣(nebulizer)，45psig;鞘氣溫度(sheath gas temperature), 350°C ;鞘氣流速，lOL/min;毛細(xì)管電壓，4000V;維孔電壓(skimmer)，65V;0CT IRF Vpp，750V;碎片電壓(fragmentor voltage),120V，碰撞電壓，45V。正離子模式為全程監(jiān)測(cè)模式，一級(jí)離子掃描范圍設(shè)置為m/z 100?1000，二級(jí)離子掃描范圍設(shè)置為m/z 50?1000。數(shù)據(jù)采集模式:子離子掃描(product 1nscan)、多反映監(jiān)測(cè)掃描(mult1-react1ns monitoring，MRM)、母離子掃描(precursor 1nscan) ο
[0050]數(shù)據(jù)米集及處理分別米用Agi lent Mass Hunter Acquisit1n SoftwareVers1n.A.01.00(Agilent Technologies)及Mass Hunter Workstat1n SoftwareVers1n B.02.00(Agilent Technologies)分析軟件。
[0051 ] LC-QTOF-MS/MS結(jié)構(gòu)驗(yàn)證:鞘氣溫度(sheath gas temperature)，400°C ;數(shù)據(jù)采集模式:Auto MS/MS ο其他條件同LC-QTOF-MS/MS質(zhì)譜表征部分。
[0052]自動(dòng)純化系統(tǒng):Waters2535四元梯度泵，SHIMADZU LC-10AD補(bǔ)償泵，Waters2767自動(dòng)進(jìn)樣器和收集器，Waters分流器(8-30ml/min，1000:1)，Waters2489雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Waters QDa檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)
[0053]自動(dòng)純化系統(tǒng)條件:色譜柱為WatersSunFire? Prep C180BD( 19 X 250mm, 5μπι)；流動(dòng)相:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B);等度洗脫程序:0?45min，9%B;流速10mL/min;進(jìn)樣量:300uL;QDa檢測(cè)條件:尚子掃描范圍設(shè)置為m/z 100?1100，正尚子模式，錐孔電壓，15V。
[0054]自動(dòng)純化系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集采WatersMassLynx4.1軟件。
[0055]1.3對(duì)照品溶液的制備
[0056]對(duì)照品溶液1:稱(chēng)取c y c I ο P am i n e、 jervine、peimisine、cycloposine和pseudo j ervine對(duì)照品適量，加甲醇溶解配置終濃度為20yg/ml的對(duì)照品溶液。
[0057]對(duì)照品溶液2:稱(chēng)取15個(gè)異留體生物堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解配置終濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。
[0058]1.4供試品溶液的制備
[0059]將藥材的干燥鱗莖粉碎至粉末狀，過(guò)60目篩，并在60°C下干燥2小時(shí)。取干燥粉末500mg，用3mL氨水(25%)堿化I小時(shí)，用50mL氯仿:甲醇混合溶液(4:1，v/v)超聲提取I小時(shí)，提取液用濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液1mL于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干，蒸干后用ImL 0.1M HCl溶解并過(guò)0.22μπι微孔濾膜備用。將MCX小柱用ImL甲醇，ImL純水活化后上樣，然后依次用Iml0.1Μ HCl，lmL甲醇除雜，最后用ImL 5%二乙胺甲醇溶液洗脫。洗脫液氮吹吹干之后定容至ImL，將該溶液在13，OOOrpm下離心1min，取上清放置于進(jìn)樣小瓶。按照此法依次處理12種貝母藥材，制備成供試品溶液。
[0060]1.5平貝母總生物堿的制備
[0061]將平貝母干燥的鱗莖粉碎，過(guò)20目篩。取約8.2kg粗粉，提取按固液比1:8的比例用95%乙醇在70°C回流提取2h，連續(xù)提取3次。合并3次提取液，濾過(guò)，減壓蒸干溶劑。殘?jiān)?br>0.lmol/L鹽酸溶解，濾過(guò)。濾液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水層，用10%氫氧化鈉調(diào)pH至9?10。用二氯甲烷萃取4次，合并二氯甲烷萃取液，減壓蒸干溶劑，制得4.7g總生物堿提取物(得率 0.06%)。
[0062]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0063]2.1環(huán)巴胺類(lèi)似物的LC-QTOF-MS/MS質(zhì)譜表征
[0064]2.1.1液相色譜和質(zhì)譜條件
[0065]為了達(dá)到良好的分離度并獲得對(duì)稱(chēng)的峰形，最終確定液相色譜條件為0.1%甲酸和1mM甲酸銨溶液-乙腈，不含糖介藜蘆異留體生物堿的碰撞能量設(shè)置為40V，含糖介藜蘆胺類(lèi)異留體生物堿的碰撞能量設(shè)置為50V。
[0066]2.1.2介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的裂解碎片研究
[0067]對(duì)5個(gè)介藜蘆類(lèi)異留體生物堿進(jìn)行QT0F-MS/MS分析，總結(jié)其裂解規(guī)律。從圖1中可以看出，在碰撞能量為40V時(shí)，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的共有子離子峰為m/z 67.05,m/z 81.07,m/z84.08、m/z 85.06、m/z 109.10和m/z 114.09，其中m/z 67.05,m/z 84.08,m/z 109.10,m/z114.09的離子豐度百分比均在20%以上，并且基峰離子是m/z 109.10或m/z 114.09，這為后期采用QTOF-MS/MS法驗(yàn)證通過(guò)QQQ-MS/MS法初步篩選發(fā)現(xiàn)的環(huán)巴胺類(lèi)似物的真實(shí)性提供了依據(jù)。
[0068]2.2基于LC-QQQ-MS/MS技術(shù)篩選貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物
[0069]2.2.1異留體生物堿全掃描和子離子掃描模式分析
[0070]利用儀器自動(dòng)優(yōu)化的功能，以5種介藜蘆類(lèi)異留體生物堿混合對(duì)照品溶液(“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液I)優(yōu)化的裂解電壓為120V，碰撞能量為45V。在此條件下，對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，確定5種介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿的準(zhǔn)分子離子分別為CAm/z 412.3,CS m/z 574.4,JVm/z426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z 428.3。然后以上述離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，在上述已優(yōu)化的質(zhì)譜條件下測(cè)得主要的子離子均為m/z 67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.Um/z 109.1和m/z 114.1，且這6個(gè)子離子的豐度均在20%以上，其中m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1的豐度在50%以上。
[0071 ] 2.2.2異留體生物堿的母離子掃描模式分析
[0072]2.1.2中的結(jié)果顯示，5個(gè)介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿對(duì)照品的共有子離子峰為m/z
67.05、m/z81.07、m/z84.08、m/z 85.06、m/z 109.10及m/z 114.09，其中m/z 109.10或者m/z 114.09是基峰，m/z 67.05是除了m/z 109.10和m/z 114.09離子之外豐度較高的離子。在采用母離子掃描模式掃描母離子時(shí)，軟件中設(shè)置的產(chǎn)物離子不能超過(guò)4個(gè)，以1.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1、2為對(duì)象優(yōu)化母離子掃描模式的參數(shù)，最終確定母離子掃描模式中設(shè)置為掃描參數(shù)的子離子是m/z67.05、m/z 84.1、m/z 109.1和m/z 114.1。在此條件下，五種介藜蘆類(lèi)異留體生物堿能夠全部被檢出，還掃描出一個(gè)藜蘆胺類(lèi)異留體生物堿。
[0073]2.2.3貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的快速檢出
[0074]基于上述優(yōu)化好的質(zhì)譜條件和選定的產(chǎn)物離子，應(yīng)用母離子掃描模式分析12種貝母屬植物藥材，圖2為貝母藥材的母離子模式掃描圖譜。在這些被掃描出來(lái)的母離子中只有少數(shù)母離子有對(duì)照品可以對(duì)比鑒定出來(lái)，對(duì)于沒(méi)有對(duì)照品的母離子是否屬于環(huán)巴胺類(lèi)似物尚需通過(guò)QT0F-MS/MS檢測(cè)結(jié)果確定。
[0075]2.3貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的驗(yàn)證
[0076]QQQ-MS/MS母離子掃描模式初步篩選出的母離子中存在假陽(yáng)性母離子，通過(guò)QTOFAuto MS/MS模式去除這部分假陽(yáng)性母離子。將QQQ-MS/MS母離子掃面模式掃描出的母離子設(shè)為需要被“Preferred”(優(yōu)先裂解)的離子;為了兼顧分子量大小不同的母離子，樣品碰撞能量設(shè)定為40V和50V(分子量在500Da以下的碰撞電壓為40V，分子量在500Da以上的碰撞電壓為40V和50V)。根據(jù)QTOF Auto MS/MS模式的掃描結(jié)果進(jìn)行篩選，當(dāng)化合物滿足m/z
67.05、m/z84.08、m/z 109.10和m/z 114.09這4個(gè)離子峰的豐度均在20%以上并且m/z109.10或者m/z 114.09為基峰(分子量大于500Da的化合物以碰撞能量50V時(shí)為準(zhǔn))時(shí)可以確定為環(huán)巴胺類(lèi)似物。
[0077]2.4自動(dòng)純化系統(tǒng)分離平貝中環(huán)巴胺類(lèi)似物m/z460.4
[0078]2.4.I自動(dòng)純化系統(tǒng)分離目標(biāo)化合物
[0079]根據(jù)QT0F-MS/MS驗(yàn)證結(jié)果，選取資源量大、含有新穎結(jié)構(gòu)的平貝母用自動(dòng)純化系統(tǒng)導(dǎo)向分離環(huán)巴胺類(lèi)似物。2.3項(xiàng)下驗(yàn)證結(jié)果顯示，平貝母中存在2個(gè)未知環(huán)巴胺類(lèi)似物:
[0080]?5.5min，m/z460.3058
[0081]@7.5min，m/z460.3053
[0082]以這兩個(gè)化合物作為分離對(duì)象，建立其自動(dòng)純化系統(tǒng)的總離子流圖圖3(B)。
[0083]根據(jù)目標(biāo)化合物m/z460.4的提取色譜圖圖3(A)確定目標(biāo)化合物的起始收集位置，以該位置的質(zhì)譜響應(yīng)響度作為質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度閾值。最終確定當(dāng)進(jìn)樣量為500yL(濃度約100mg/mL)時(shí)，分離效果較好，相應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度閾值設(shè)定為7000000。此時(shí)m/z 460.4的出峰時(shí)間段分別為12.4-13.4min、33.0-35.0min，對(duì)兩處目標(biāo)化合物分別進(jìn)行收集依次得到餾分m/z460.4(A)，m/z 460.4(B) ο
[0084]2.4.2自動(dòng)純化系統(tǒng)二次分離目標(biāo)組分
[0085]對(duì)2.4.1中分離得到的目標(biāo)化合物進(jìn)行純度測(cè)定，結(jié)果表明，所得兩個(gè)目標(biāo)化合物純度均達(dá)不到要求。為了保證目標(biāo)化合物段的純度，在之后的分離中繼續(xù)使用自動(dòng)純化系統(tǒng)進(jìn)行分離收集。
[0086]m/z460.4(A):經(jīng)優(yōu)化后，確定分離m/z460.4(A)的液相條件為:色譜柱為WatersSunFire? Prep C180BD( 19 X 250mm，5ym)；流動(dòng)相:0.I % 甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)；等度洗脫:O?60min，5 % B;當(dāng)進(jìn)樣量為I 1yL時(shí)，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度閾值設(shè)置為2600000。此時(shí)m/z460.4(A)在51.0-55.0min處出峰，目標(biāo)生物堿二次分離的圖譜見(jiàn)圖4。
[0087]m/z460.4(B):經(jīng)優(yōu)化后，確定分離m/z460.4(B)的液相條件為:色譜柱為WatersSunFire? Prep C180BD( 19 X 250mm，5ym)；流動(dòng)相:0.I % 甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)；等度洗脫:O?75min，8 % B;當(dāng)進(jìn)樣量為250yL時(shí)，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度閾值設(shè)置為800000。此時(shí)m/z460.4(B)在45.0-58.0min處出峰，目標(biāo)生物堿二次分離的圖譜見(jiàn)圖5。
[0088]2.4.3純度測(cè)定
[0089]經(jīng)LC-MS檢測(cè)，由“2.4.2”富集出來(lái)的目標(biāo)生物堿m/z 460.4(A),m/z 460.4(B)經(jīng)面積歸一化法檢測(cè)純度分別為為92.5 %、97.0 %。
[0090]實(shí)施例2
[0091]1.自動(dòng)純化系統(tǒng)分離平貝母中的貝母辛
[0092]質(zhì)譜篩選結(jié)果顯示，介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿貝母辛m/z 428.4在14.0min處出峰，并且含量很高，以貝母辛作為目標(biāo)化合物用自動(dòng)純化系統(tǒng)分離。首先建立貝母辛m/z 428.4自動(dòng)純化系統(tǒng)的總離子流圖見(jiàn)圖6(B)，根據(jù)目標(biāo)化合物m/z 428.4的提取色譜圖見(jiàn)圖6(A)確定起始收集位置，以該位置的質(zhì)譜響應(yīng)響度作為質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度閾值(MIT)。最終確定當(dāng)進(jìn)樣量為400yL(濃度約92mg/mL)時(shí)，分離效果較好，相應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度閾值設(shè)定為1600000，此時(shí)m/z 428.4在18.0-19.5min處出峰，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行收集得到饋分m/z 428.4。
[0093]m/z428.4:經(jīng)優(yōu)化后，確定分離m/z 428.4的液相條件為:色譜柱為WatersSunFire? Prep C180BD( 19 X 250mm，5ym)；流動(dòng)相:0.I % 甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)；等度洗脫:O?40min，14 % B。
[0094]2.純度測(cè)定
[0095]經(jīng)LC-MS檢測(cè)，由T富集出來(lái)的目標(biāo)生物堿m/z428.4經(jīng)面積歸一化法檢測(cè)純度為 95.3%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法，其特征在于: 以介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿對(duì)照品的共有產(chǎn)物離子為導(dǎo)向，通過(guò)引入LC-QTOF-MS/MS技術(shù)，建立了介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的快速表征方法，再借助LC-QQQ-MS/MS強(qiáng)大的篩選功能，從貝母屬藥材中篩選出了一系列環(huán)巴胺類(lèi)似物，然后采用自動(dòng)純化系統(tǒng)根據(jù)餾分的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行餾分的制備。2.根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法，其特征在于: 介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的質(zhì)譜表征:采用LC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)介藜蘆類(lèi)異甾體生物堿進(jìn)行質(zhì)譜表征，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律提出診斷離子； 在液相色譜參數(shù)和其他質(zhì)譜參數(shù)固定的前提下，在25?60V區(qū)間內(nèi)，以5V為間隔對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化;通過(guò)比較不同介藜蘆類(lèi)異留體生物堿對(duì)照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和豐度變化，分子中不含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿最佳碰撞能量為35?45V，此時(shí)前體母離子已經(jīng)碎裂，特征子離子m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 85.06 ,m/z 109.10 ,m/z 114.09的豐度達(dá)到最大； 同樣地，含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿最佳碰撞能量為45?55V;另外，隨著碰撞能量加大到50?60V，所有生物堿二級(jí)質(zhì)譜的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09轉(zhuǎn)移為m/z.67.05;綜合以上信息，選擇40V作為不含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的碰撞能量，50V作為含糖的介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的碰撞能量，在此電壓下，m/z 67.05 ,m/z 84.08 ,m/z.109.10,m/z 114.09的離子豐度百分比均在20%以上，并且基峰離子是m/z 109.10或m/z.114.09,將這四種離子作為介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的診斷碎片離子； 貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的化學(xué)篩選:采用LC-QQQ-MS/MS聯(lián)用技術(shù)篩選貝母屬植物中的環(huán)巴胺類(lèi)似物； 以5種介藜蘆類(lèi)異留體生物堿混合對(duì)照品溶液在ESI正離子模式下進(jìn)行裂解電壓、碰撞能量的優(yōu)化；使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，在100?180V區(qū)間內(nèi)，以20V為間隔對(duì)裂解電壓進(jìn)行優(yōu)化;使用子離子掃描模式，在40?60V區(qū)間內(nèi)，以5V為間隔對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化;最終確定裂解電壓為120V，碰撞能量為45V;并對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，確定5種介藜蘆類(lèi)異留體生物堿的準(zhǔn)分子離子分別為CA m/z 412.3、CS m/z 574.4、JV m/z 426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z.428.3;然后以上述離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，測(cè)得主要的子離子均為m/.z67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1 和m/z 114.1，且這6個(gè)子離子的豐度均在20%以上，其中m/z 67.05,m/z 109.1和m/z 114.1的豐度在50%以上; 在采用母離子掃描模式掃描母離子時(shí)，軟件中設(shè)置的產(chǎn)物離子不能超過(guò)4個(gè)；以15種異甾體生物堿對(duì)照品為對(duì)象優(yōu)化母離子掃描模式的參數(shù)，將豐度最高的m/z 67.05、m/z109.1和m/z 114.1固定為產(chǎn)物離子，再?gòu)膍/z 81.07、m/z 84.08和m/z 85.06中選擇I個(gè)最合適的產(chǎn)物離子；當(dāng)掃描路徑為m/z 67.05、m/z 109.1、m/z 114.1和m/z 84.08時(shí)，介藜蘆類(lèi)異留體生物堿全部被檢出，還掃描出一個(gè)藜蘆胺類(lèi)異留體生物堿;QQQ-MS/MS在母離子掃描模式下，只要母離子的碎片中含有PreIS模式設(shè)置的子離子，無(wú)論豐度高低，檢測(cè)器都會(huì)采集到信號(hào)，所以會(huì)采集到假陽(yáng)性母離子;最終確定母離子掃描狀態(tài)下的4個(gè)產(chǎn)物離子參數(shù)為m/z 67.05、!11/284.08、111/2109.10、111/2114.09;應(yīng)用母離子掃描模式對(duì)不同品種不同批次的貝母屬藥材進(jìn)行分析檢測(cè)，可以得到一系列可能的環(huán)巴胺類(lèi)似物； 環(huán)巴胺類(lèi)似物的驗(yàn)證:采用LC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)驗(yàn)證貝母屬中存在的環(huán)巴胺類(lèi)似物； 借助QTOF Auto MS/MS模式去除QQQ-MS/MS母離子掃描模式中的假陽(yáng)性母離子;將QQQ-MS/MS掃描出來(lái)的母離子設(shè)為需要被“preferred”離子，樣品碰撞能量設(shè)定為40V和50V，分子量在500Da以下的碰撞電壓為40V，分子量在500Da以上的碰撞電壓為40V和50V，根據(jù)QTOFAuto MS/MS模式的掃描結(jié)果進(jìn)行篩選，當(dāng)化合物滿足m/z 67.05,m/z 84.08,m/z 109.10和m/z 114.09這4個(gè)離子峰的豐度均在20%以上并且m/z 109.10或者m/z 114.09為基峰時(shí)(分子量大于500Da的化合物以50V時(shí)為準(zhǔn))，可以確定為環(huán)巴胺類(lèi)似物； 根據(jù)篩選結(jié)果，選取資源量大、介藜蘆類(lèi)異留體生物堿含量相對(duì)較高或含有新穎結(jié)構(gòu)的貝母用自動(dòng)純化系統(tǒng)分離制備環(huán)巴胺類(lèi)似物。3.根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法，其特征在于: 收集方法的設(shè)置:根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)觸發(fā)收集;首先采集一針總生物堿的色譜圖，使目標(biāo)化合物與周?chē)s質(zhì)有盡量好的分離度，根據(jù)目標(biāo)化合物m/z 460.4的提取色譜圖確定目標(biāo)化合物的起始收集位置，以該位置的質(zhì)譜響應(yīng)響度作為收集方法中質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度閾值；經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，最終確定分離目標(biāo)生物堿m/z460.4的液相條件為:色譜柱為WatersSunFire? Prep C180BD( 19 X 250mm，5ym)；流動(dòng)相:0.I % 甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)；等度洗脫:O?45min,9%B；流速:10ml/min；當(dāng)流動(dòng)相流速為10ml/min時(shí)，相應(yīng)的延遲時(shí)間設(shè)置為17s;在進(jìn)樣量約為50mg的貝母總生物堿的質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物m/z 460.4在兩個(gè)位置出峰，出峰時(shí)間段分別為12.4-13.4min、33.0-35.0min，對(duì)兩處目標(biāo)化合物分別進(jìn)行收集得到目標(biāo)化合物餾分。4.根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)譜導(dǎo)向分離貝母屬植物中環(huán)巴胺類(lèi)似物的方法，其特征在于: 其中貝母總生物堿的制備方法如下: 將貝母藥材干燥的鱗莖粉碎，過(guò)20目篩；取約400g粗粉，提取按固液比1:8的比例用95%乙醇在70°C回流提取2h，連續(xù)提取3次;合并3次提取液，濾過(guò)，減壓蒸干溶劑;殘?jiān)?0.lmol/L鹽酸溶解，濾過(guò);濾液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水層，用10%氫氧化鈉調(diào)pH至9?10;用二氯甲烷萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，減壓蒸干溶劑，供自動(dòng)純化系統(tǒng)上樣用。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106053623SQ201610316535
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】姜艷, 李會(huì)軍, 杜園
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué), 中國(guó)藥科大學(xué)