評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法和花粉提取液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法和花粉提取液及其制備方法，評(píng)價(jià)方法包括：分別制備轉(zhuǎn)基因和同一品種非轉(zhuǎn)基因植物的花粉提取液；花粉提取液的制備包括：采集植物花粉，粉碎，加入提取緩沖液進(jìn)行震蕩提取，提取完成后離心，上清液即為花粉提取液；提取緩沖液由一定濃度的KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl和吐溫20組成；向花粉提取液中加入蔗糖，制得飼喂液；采用飼喂液喂食蜜蜂，比較蜜蜂死亡率，判斷轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂的毒性。本發(fā)明能夠模擬蜜蜂在自然情況下取食轉(zhuǎn)基因花粉的真實(shí)情況。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法和花粉提取液 及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)，尤其涉及一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué) 效應(yīng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米作為世界重要的糧食作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛作為人類(lèi)口糧及動(dòng)物飼 料，但是病蟲(chóng)害嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗蟲(chóng)、抗病等外源基因引入 到玉米基因組中，培育抗蟲(chóng)、抗病轉(zhuǎn)基因水稻新品種，已成為防控玉米病蟲(chóng)害提高玉米產(chǎn)量 的新方法和新途徑。隨著轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模推廣，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注于它的安全性問(wèn)題。由 于我國(guó)玉米生產(chǎn)和消費(fèi)在全球的重要地位和影響，我國(guó)政府對(duì)于轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化生產(chǎn) 持非常謹(jǐn)慎和認(rèn)真的態(tài)度，既考慮到轉(zhuǎn)基因玉米未來(lái)商業(yè)化帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)影 響，同時(shí)也對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米大規(guī)模環(huán)境釋放和種植可能帶來(lái)的潛在生物安全問(wèn)題進(jìn)行科學(xué)和 認(rèn)真的評(píng)價(jià)。
[0003] 蜜蜂是環(huán)境毒理學(xué)研究中的重要模式生物，廣泛用于各種化學(xué)品毒性安全評(píng)價(jià)。 蜜蜂廣泛分布于自然界中，一般只以花粉與花蜜為食物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在人類(lèi)常用的1300多種作 物中，有超過(guò)1000種依靠蜜蜂授粉，如果轉(zhuǎn)基因玉米的花粉對(duì)蜜蜂產(chǎn)生毒害作用，就可能導(dǎo) 致當(dāng)?shù)孛鄯浞N群的崩潰。蜜蜂位于自然界生物鏈的相對(duì)底層，是連接植物和動(dòng)物的橋梁，如 果在這一環(huán)節(jié)出現(xiàn)斷裂，在生物鏈上處于其前后的大批生物都要遭殃。最直觀的例子，蜜蜂 種群的崩潰會(huì)影響到其他作物的開(kāi)花結(jié)果，從而釀成廣泛的糧食危機(jī)與生態(tài)危機(jī)。因此以 蜜蜂為研究對(duì)象開(kāi)展轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全評(píng)價(jià)很有實(shí)際意義。
[0004] 目前國(guó)際上較為通用的關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全評(píng)價(jià)主要以含有相對(duì)應(yīng)的單 一純化蛋白的蔗糖溶液為主要食物對(duì)蜜蜂進(jìn)行人工培養(yǎng)并開(kāi)展毒理學(xué)評(píng)價(jià)，具體為以大腸 桿菌(E.coli)為載體表達(dá)外源蛋白，在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過(guò)純化，按照需要的濃度配制蔗糖溶液 飼喂蜜蜂，并觀察致死效應(yīng)。這種方法可適用于只表達(dá)一個(gè)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的安全 性評(píng)價(jià);如果轉(zhuǎn)基因植物中同時(shí)表達(dá)2個(gè)或者2個(gè)以上的外源蛋白，則只能用這個(gè)方法分別 評(píng)價(jià)每個(gè)外源蛋白對(duì)蜜蜂的影響。這種方忽略了蜜蜂取食花粉的實(shí)際情況與實(shí)際攝入量， 而涉及到雙價(jià)或者多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的情況則更為復(fù)雜，因?yàn)閮煞N蛋白的表達(dá)量可能存在很 大差別，甚至可能存在相互影響，那么分別以對(duì)應(yīng)蛋白的蔗糖溶液來(lái)喂養(yǎng)蜜蜂就無(wú)法準(zhǔn)確 地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米花粉對(duì)蜜蜂的真實(shí)影響。目前這種方法的評(píng)價(jià)結(jié)果無(wú)法代表蜜蜂取食轉(zhuǎn) 基因植物花粉的真實(shí)影響，原因如下:第一，不同的外源蛋白之間可能存在相互作用，多個(gè) 單一外源蛋白各自對(duì)蜜蜂的毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果不能代表蜜蜂同時(shí)取食多個(gè)外源蛋白時(shí)的實(shí) 際影響；第二，即使是同一基因，微生物表達(dá)的外源蛋白與轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的外源蛋白可 能存在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)方面的差異;第三，轉(zhuǎn)基因植物中同時(shí)表達(dá)的多個(gè)外源蛋白的表達(dá)量 之間存在較大差異，目前的評(píng)價(jià)方法無(wú)法模擬蜜蜂取食不同表達(dá)量的外源蛋白時(shí)受到的實(shí) 際影響。根據(jù)我們的測(cè)定，以C0030.3.5雙價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米為例，BT與EPSPS兩種蛋白的濃度差 別很大，用相同濃度分別飼喂并得出毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果并不科學(xué)，而且也不能真實(shí)反映兩種 蛋白被蜜蜂同時(shí)取食時(shí)可能存在的交互作用。第四，外源基因的表達(dá)不僅僅會(huì)產(chǎn)生外源蛋 白，還可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生一些非預(yù)期的性狀變化，如花粉中其他某些化學(xué)物質(zhì)含量 的變化，這些非預(yù)期效應(yīng)是無(wú)法僅僅通過(guò)飼喂不同的轉(zhuǎn)基因蛋白所能夠評(píng)價(jià)的。
[0005] 為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)蜜蜂的毒理學(xué)效應(yīng)，迫切需要一種可以最大限度 模擬蜜蜂在自然界取食花粉的真實(shí)情況的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于通過(guò)用破碎、溶劑提取 轉(zhuǎn)基因植物花粉后制備蔗糖溶液并飼喂蜜蜂，不僅可以同時(shí)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉中所有外 源蛋白對(duì)蜜蜂的綜合影響，而且可以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉可能產(chǎn)生的非預(yù)期變化對(duì)蜜蜂的 影響，更好地模擬蜜蜂在自然情況下取食轉(zhuǎn)基因植物花粉的真實(shí)情況，解決當(dāng)前技術(shù)方法 中存在的不能真實(shí)反映蜜蜂受到轉(zhuǎn)基因植物花粉影響的問(wèn)題。
[0007] 技術(shù)方案:一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法，包括：
[0008] (1)分別制備轉(zhuǎn)基因植物和同一品種非轉(zhuǎn)基因植物的花粉提取液；
[0009]所述花粉提取液的制備方法包括:米集植物的花粉，將花粉粉碎，加入提取緩沖液 進(jìn)行研磨至95%以上花粉破壁后震蕩提取，提取完成后離心，上清液即為所述的花粉提取 液；所述的提取緩沖液的組成為：0.0018~0.0022mol · L-^IfePOhO.Ol~0.012mol · L- 1恥2冊(cè)04、0.12~0.14111〇1.廠1恥(：1、0.002~0.003111〇1.廠 11((：1、0.03~0.06%吐溫20;所述 的提取緩沖液以水為溶劑；
[0010] (2)向花粉提取液中加入蔗糖，制得飼喂液；
[0011] (3)采用所述的飼喂液喂食蜜蜂，比較轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組蜜蜂的死亡率，判斷 轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂的毒性。
[0012] 所述植物為玉米。
[0013] 所述的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)入有多個(gè)外源基因，具體的可以有兩個(gè)外源基因。
[0014] 花粉粉碎采用液氮研磨的方法，液氮研磨的時(shí)間為30~45min，以盡可能的破壞花 粉壁，釋放花粉中物質(zhì)。
[0015] 優(yōu)選的，所述提取緩沖液的配方為：0.002mol · L-kftiPOhO.Olmol · L-^12冊(cè)〇4、 0.137mol · L-iNaCl'O.OOSTmol · L-^CUO.OS^WAOTweer^O^H 7·4〇
[0016] 所述提取的溫度為4~8°C，時(shí)間為0.5~2h，優(yōu)選的，所述提取的溫度為4°C，時(shí)間 為lh，可以充分提取花粉中物質(zhì)，并保持物質(zhì)活性。
[0017] 所述的花粉與提取緩沖液的質(zhì)量體積比(g/ml)為0.3~4:3。
[0018] 飼喂液中，所述蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%。
[0019] 所述蜜蜂為意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica Spin.)。
[0020] 實(shí)驗(yàn)時(shí)，所述蜜蜂的飼養(yǎng)條件為：飼養(yǎng)溫度為25±2°C，濕度為50-70%，光照與黑 暗時(shí)間比為12h:12h。采用所述的飼喂液喂食蜜蜂前，對(duì)蜜蜂進(jìn)行饑餓處理2h。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種花粉提取液的制備方法，包括:采集植物的花粉，將花粉粉 碎，加入提取緩沖液進(jìn)行研磨至95 %以上花粉破壁后震蕩提取，提取完成后離心，上清液即 為所述的花粉提取液;所述的提取緩沖液的組成為:〇.〇lmol · L-· L-SaCl、 0.0027mol · L_1KCUO.05% (V/V)Tween20,pH 7.4〇
[0022] 本發(fā)明還提供了一種所述制備方法制備得到的花粉提取液。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0024]本發(fā)明通過(guò)機(jī)械磨碎轉(zhuǎn)基因玉米花粉并提取配制蔗糖溶液來(lái)喂養(yǎng)蜜蜂，較為真實(shí) 地模擬蜜蜂在自然情況下取食轉(zhuǎn)基因玉米花粉的情況，首先，本發(fā)明用到的材料是真實(shí)的 轉(zhuǎn)基因玉米花粉，而并非現(xiàn)有方法中常用的通過(guò)大腸桿菌表達(dá)并經(jīng)過(guò)純化的目的蛋白；其 次，本發(fā)明真實(shí)反映了多種目的蛋白在多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米花粉中表達(dá)濃度的比例及可能存在 的相互影響，避免了分別用純化蛋白配制蔗糖溶液飼喂蜜蜂而帶來(lái)背離真實(shí)情況的問(wèn)題； 再次，本方法還可以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米可能出現(xiàn)的非預(yù)期效應(yīng)對(duì)蜜蜂的影響；另外，用微生物 表達(dá)多個(gè)外源蛋白并純化，之后再分別進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)，其步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，經(jīng)濟(jì)成本 很高，而本方法則簡(jiǎn)單易行，大幅度降低了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。
[0025] 本發(fā)明在花粉提取液的制備過(guò)程中，對(duì)制備條件進(jìn)行控制特別是通過(guò)選擇特定的 提取緩沖液，對(duì)玉米花粉中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取效率與常規(guī)方法的提取效率無(wú)顯著差異， 因此以該提取方法得到的花粉提取液為基礎(chǔ)的后續(xù)評(píng)價(jià)方法具有較高的可行性和可靠性。
[0026] 由于花粉之間相互粘連，直接用花粉喂食蜜蜂會(huì)存在取食量不可控的問(wèn)題，難以 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，而本發(fā)明采用花粉提取液，蜜蜂取食方便，取食量統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)單易行，且本發(fā)明 花粉提取液制備方法簡(jiǎn)單，可靠，保證提取物的活性。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為不同處理組意大利蜜蜂存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 測(cè)試物質(zhì)為抗蟲(chóng)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5花粉及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅BN318玉米 花粉。其中，轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5轉(zhuǎn)入的基因?yàn)閏ry lAb和epsps，轉(zhuǎn)入的目標(biāo)性狀為抗蟲(chóng)、 抗除草劑，上述材料均由大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心提供。
[0031] 實(shí)施例1花粉提取液的制備
[0032] 精確稱取玉米花粉0.3g，放入研缽中，緩慢加入液氮研磨30分鐘以上，隨后加入 3mL提取緩沖液（0.002mol · L-l^POhO.Olmol · 137mol · L-WaCl、 0.0027111〇1.1/11((：1、0.05%(￥八)了￥661120，？!17.4，水為溶劑)繼續(xù)研磨至電子顯微鏡鏡檢 確認(rèn)95%以上花粉成功破壁;然后轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，4°C，200rpm搖床孵育lh，4°C條件下 12000rpm離心1 Omin，取上清液，即為花粉提取液。
[0033] 用對(duì)應(yīng)的試劑盒（EnvirologixQualiplate Kit for CrylAb/CrylAc，Part# 10433，EnvirologixQualiPlate Kit for CP4EPSPS Corn&Cotton，Part#10448)分別測(cè)定 玉米花粉中的CrylAb蛋白和EPSPS蛋白的含量。經(jīng)測(cè)定，本次研究所使用的轉(zhuǎn)基因玉米 C0030.3.5花粉中Bt蛋白含量為24. lng/g，EPSPS蛋白為118.8yg/g，非轉(zhuǎn)基因玉米 DBN318Cry lAb與EPSPS蛋白含量均低于試劑盒檢測(cè)極限。
[0034]我們以C0030.3.5和DBN318為材料，用常規(guī)超聲方法提取測(cè)定(蛋白質(zhì)采用凱式定 氮法，總糖測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，其余各種氨基酸和維生素的測(cè)定采用高效液相色譜 法)花粉中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并用本方法作為比較，測(cè)定了花粉提取液中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 結(jié)果歸納為下表：
[0035]

[0037]
[0038] 結(jié)果說(shuō)明，本提取方法對(duì)玉米花粉中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取效率與常規(guī)方法的提取 效率無(wú)顯著差異，因此以本提取方法為基礎(chǔ)的后續(xù)評(píng)價(jià)方法具有較高的可行性和可靠性。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 評(píng)價(jià)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法包括以下步驟：
[0041 ]參照實(shí)施例1花粉提取的制備方法，分別稱取4g C0030.3.5和DBN318玉米花粉，放 入研缽中，緩慢加入液氮研磨35分鐘，然后用3mL實(shí)施例1配方的提取緩沖液研磨至電子顯 微鏡鏡檢確認(rèn)95%以上花粉成功破壁;然后轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，4°C，200rpm搖床孵育lh，4 °C條件下12000rpm離心10min，取上清液，超濾離心，最后定容至lmL，以此液配制鹿糖溶液， 蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，Bt蛋白濃度約96.4ng/mL，EPSPS蛋白濃度約為475.2yg/mL。此濃度 約為蜜蜂正常暴露量的10-40倍。
[0042]計(jì)算依據(jù)：蜜蜂每頭每天平均取食花粉約6.5mg或取食蔗糖溶液約20-90mg (Crailsheim et al.，1992;Rortais et al. ,2005)。以僅取食花粉計(jì)算，24.1ng/gX6.5mg =0.15665ng，即正常取食花粉時(shí)，每日攝取Bt毒蛋白大概0.16ng，以此作為每日的標(biāo)準(zhǔn)暴 露量。如果取食蔗糖溶液，每日20-90mg，按照60 %蔗糖溶液1.3g/mL的密度(實(shí)測(cè))計(jì)算，最 低取食量（鹿糖溶液體積）為20mg/(l .3g/mL) =0.0154mL，0.0154mLX96ng/mL= 1.48ng。 1.48ng/0.15665ng = 9.45，即實(shí)驗(yàn)蜜蜂取食配制的鹿糖溶液時(shí)，按照最低取食量來(lái)計(jì)算，Bt 蛋白的暴露量約為標(biāo)準(zhǔn)暴露量的9.45倍。這個(gè)是假設(shè)每日只取食20mg蔗糖溶液計(jì)算的，如 果是按照90mg取食量，則暴露量約為標(biāo)準(zhǔn)暴露量的9.45 X (90/20) = 4.5 X 9.45 = 42.5倍。 EPSPS蛋白的暴露量計(jì)算與Bt蛋白類(lèi)似，并不影響暴露劑量倍數(shù)的變化，不再另行計(jì)算。 [0043] 取120只意大利蜜蜂隨機(jī)分配到蜂籠中，隨機(jī)分配到12只蜂籠中，每只蜂籠10只意 大利蜜蜂在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)一直到實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，使其適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)的條件。隨后對(duì)蜜蜂進(jìn)行饑 餓處理2h，以保證在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蜜蜂腹中食物含量基本相同。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將120只預(yù)培養(yǎng) 的意大利蜜蜂分為4組，即每組30只意大利蜜蜂，分別飼喂1.5mL的上述三種蔗糖溶液(蔗糖 溶液組:蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 %，水為溶劑，空白對(duì)照組(CK); DBN318玉米花粉組;C0030.3.5 玉米花粉組;含有6.67mg/L三唑磷乳油的60%蔗糖(w/v)溶液，陽(yáng)性對(duì)照組），每天飼喂2次， 每次0.75mL，每天觀察記錄各組蜜蜂的存活情況，在飼喂實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后24h、48h、72h記錄死亡 率，并及時(shí)清理掉實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡的蜜蜂個(gè)體。
[0044] 實(shí)驗(yàn)在飼養(yǎng)溫度為25 ± 2 °C，濕度50-70 %的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照與黑暗時(shí)間比為 12h:12h〇
[0045]統(tǒng)計(jì)方法
[0046]使用SPSS17.0軟件中的AN0VA程序?qū)Ω鹘M意大利蜜蜂的存活率指標(biāo)進(jìn)行顯著性差 異分析(α = 0·05)。
[0047] 圖1顯示的是不同飼喂處理?xiàng)l件下各組意大利蜜蜂的存活情況。由圖1可知，本實(shí) 驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照的三唑磷乳油組意大利蜜蜂在24h內(nèi)平均死亡率達(dá)到68.75%，在48h內(nèi) 全部死亡，而空白對(duì)照組意大利蜜蜂在24h內(nèi)沒(méi)有死亡現(xiàn)象，表明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)試系統(tǒng)既能夠 保證意大利蜜蜂的正常生長(zhǎng)，也可以測(cè)定出有毒物質(zhì)對(duì)意大利蜂的急性毒殺效應(yīng)，說(shuō)明本 實(shí)驗(yàn)的測(cè)試系統(tǒng)是可信的。在這種情況下，DBN318花粉處理組和C0030.3.5花粉處理組意大 利蜜蜂在24h、48h和72h的死亡率之間都沒(méi)有顯著性差異，它們與無(wú)花粉的空白對(duì)照組意大 利蜂在死亡率方面也沒(méi)有顯著性差異，這說(shuō)明高劑量的轉(zhuǎn)Bt+EPSPS基因抗蟲(chóng)抗除草劑玉米 花粉對(duì)意大利蜂沒(méi)有急性毒殺效應(yīng)。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)期間的觀察，各實(shí)驗(yàn)組意大利蜂個(gè)體在 活動(dòng)能力和振翅音方面也未見(jiàn)顯著差異。因此，本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)Bt+EPSPS基因抗蟲(chóng)抗除 草劑玉米花粉對(duì)意大利蜂沒(méi)有急性毒性效應(yīng)。說(shuō)明抗蟲(chóng)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5花 粉對(duì)意大利蜜蜂生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。
[0048] 結(jié)論:通過(guò)對(duì)以上有效、可靠的試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)對(duì)所得數(shù)據(jù)分析，得出結(jié)論:取食10倍日 攝食量的抗蟲(chóng)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5玉米花粉沒(méi)有引起意大利蜜蜂在生長(zhǎng)方面的 不良反應(yīng)，表明C0030.3.5轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)非靶標(biāo)生物意大利蜜蜂沒(méi)有顯著的不利影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物花粉對(duì)蜜蜂毒理學(xué)效應(yīng)的方法，其特征在于，包括： (1) 分別制備轉(zhuǎn)基因植物和同一品種非轉(zhuǎn)基因植物的花粉提取液； 所述花粉提取液的制備方法包括:米集植物的花粉，將花粉粉碎，加入提取緩沖液進(jìn)行 研磨至95%以上花粉破壁后震蕩提取，提取完成后離心，上清液即為所述的花粉提取液;所 述的提取緩沖液的組成為：0.0018~0.0022mol · L-kifePOhO.Ol~0.012mol · L- 0.12~0.14111〇1*1/1似(：1、0.002~0.003111〇1*1/11((：1、0.03~0.06%吐溫20 ;所述的提取緩 沖液以水為溶劑； (2) 向花粉提取液中加入蔗糖，制得飼喂液； (3) 采用所述的飼喂液喂食蜜蜂，比較轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組蜜蜂的死亡率，判斷轉(zhuǎn)基 因植物花粉對(duì)蜜蜂的毒性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，植物為玉米。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)入有兩個(gè)外源基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，花粉粉碎采用液氮研磨的方法，液氮研磨 的時(shí)間為30~45min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取的溫度為4~8°C，時(shí)間為0.5~ 2h〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的花粉與提取緩沖液的質(zhì)量體積比為 0.3 ~4:3〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，飼喂液中，所述蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 %。8. -種花粉提取液的制備方法，其特征在于，包括:采集植物的花粉，將花粉粉碎，加入 提取緩沖液進(jìn)行研磨至95%以上花粉破壁后震蕩提取，提取完成后離心，上清液即為所述 的花粉提取液；所述的提取緩沖液的組成為：〇.〇lmol · · LlaCl、 0.0027mol · L_1KCU0.05% (V/V)Tween20,pH 7.4〇9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述提取的溫度為4~8°C，時(shí)間為0.5 ~2h〇10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9制備方法制備得到的花粉提取液。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK105866352SQ201610402633
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉標(biāo), 郭汝清, 方志翔
【申請(qǐng)人】環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所