一種動物源性食品中氟唑菌酰胺殘留的快速測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動物源性食品中氟唑菌酰胺殘留的快速測定方法，更具體地說是 采用氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源-質(zhì)譜(GC-NCI-MS)定性定量測定豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等動 物肌肉及制品等脂肪含量高的動物源性食品中殘留的氟唑菌酰胺含量的方法，屬于農(nóng)藥殘 留量的測定技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)是由巴斯夫公司開發(fā)的琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌 劑?；瘜W(xué)名稱:3_二氟甲基-1-甲基-N-(3'，4'，5'_三氟聯(lián)苯-2-基)-1Η-吡唑-4-甲酰胺;分 子式:C18H12F5N30;相對分子質(zhì)量:381.3;恪點(diǎn)：157 °C ;相對密度：1.42。溶劑中的溶解度 (g/L，20°C):丙酮>250、乙腈168、乙酸乙酯123、甲醇53.4、甲苯20.0。氟唑菌酰胺的化學(xué)結(jié) 構(gòu)式如下：
[0003] 氟唑菌酰胺具有高效、廣譜、持效、優(yōu)異的內(nèi)吸傳導(dǎo)性、同時具有預(yù)防和治療作用 等優(yōu)點(diǎn)。它能抑制孢子發(fā)芽、芽孢管伸長、菌絲體生長和孢子形成，可有效防治谷物、大豆、 玉米、油菜和特種作物等的主要病害。該產(chǎn)品通過葉面和種子處理來防治一系列真菌病害， 如谷物、大豆、果樹和蔬菜上由殼針孢菌（Septoria)、灰葡萄孢菌（Botrytis)、白粉菌 (Erysiphe)、尾抱菌（Cercospora)、柄銹菌（Puccinia)、絲核菌（Rhizoctonia)、核腔菌 (Pyrenophora spp ·)等引起的病害。其特別適用于豆類植物，防治由鏈格孢菌(Alternaria spp.)引起的灰霉病(Botrytis cinerea)、銹病、白粉病和殼針孢菌引起的病害，大豆銹病 (Phakopsora)，棉花上由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起的病害以及向日葵和油籽 菜上由鏈格孢菌引起的病害等。在所有試驗(yàn)劑量下，對所有作物非常安全。氟唑菌酰胺適配 性強(qiáng)，可與吡唑醚菌酯、三唑類殺菌劑和巴斯夫其他產(chǎn)品復(fù)配使用。研究表明，氟唑菌酰胺 比市售的酰胺類殺菌劑具有更好的活性，該產(chǎn)品無論在活性、多功能性，還是在內(nèi)吸性和耐 雨水沖刷性等方面都為現(xiàn)代殺菌劑建立了新標(biāo)桿。巴斯夫打算將氟唑菌酰胺引入世界上50 多個國家，用于100多種作物上。2011年，氟唑菌酰胺首先在英國登記和上市，現(xiàn)登記和上市 的國家包括澳大利亞、美國、加拿大、歐盟13國、巴西和中國等。公司預(yù)測，該產(chǎn)品的年峰值 銷售額可達(dá)6億歐元。這是所有SDHI類殺菌劑中，開發(fā)公司寄予的期望值最高的產(chǎn)品。
[0004] 隨著氟唑菌酰胺的登記、推廣和使用，作為我國主要出口市場的美國、加拿大等國 家制定了其在蔬菜、水果、糧谷和畜產(chǎn)品等食品農(nóng)產(chǎn)品中的最大允許殘留量(MRL)，如美國 規(guī)定氟唑菌酰胺在果蔬中的MRL為0.5~30mg/kg，在畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品等動物源性食品中MRL 為0 . Olmg/kg，在堅果及糧谷中MRL為0.06~15mg/kg;加拿大規(guī)定氟唑菌酰胺在果蔬中的 MRL為0.02~2mg/kg，在畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品等動物源性食品中MRL為0.01~0.05mg/kg，在堅果 及糧谷中MRL為0.01~3mg/kg;歐盟、日本等國家規(guī)定若田間使用農(nóng)藥沒有在該國家登記， 沒有制定相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時，出口至其國家的食品農(nóng)產(chǎn)品包括畜禽肉等動物源性食品 中殘留限量均實(shí)行〇.〇lmg/L的"一律標(biāo)準(zhǔn)"。
[0005] 現(xiàn)階段，對氟唑菌酰胺殘留量測定方法的研究較少，報道的檢測方法主要為蔬菜 和水果中氟唑菌酰胺殘留檢測方法，這些檢測方法均采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測 定蔬菜和水果中氟唑菌酰胺殘留量的檢測方法，使用LC-MS/MS測定食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留 具有快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于其價格較昂貴，很多檢測機(jī)構(gòu)、企業(yè)或科研院所未 配置該儀器或配置臺數(shù)較少，由于不同的化合物采用LC-MS/MS檢測時，需使用不同的流動 相或色譜柱，這樣需要不斷更換色譜柱、流動相并耗費(fèi)比較長的時間對系統(tǒng)進(jìn)行平衡，這一 定程度上制約了 LC-MS/MS的應(yīng)用。配備負(fù)化學(xué)電離源的氣相色譜質(zhì)譜(GC-NCI -MS)分析食 品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留具有很大優(yōu)勢，負(fù)化學(xué)離子源(NCI源)被稱為質(zhì)譜"軟電離源"，對含電 負(fù)性集團(tuán)的分析物具有高選擇性和高靈敏度，由于其特征性強(qiáng)，利用其進(jìn)行殘留分析時，基 質(zhì)干擾很少，可很準(zhǔn)確地對目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量分析?，F(xiàn)各種檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)均購置了 氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)，一般也都配備了負(fù)化學(xué)離子源(NCI)，現(xiàn)很多類農(nóng)藥均含有電負(fù) 性基團(tuán)，有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥分子大都含有一F、一C1、一Br或一C00-等強(qiáng)電負(fù)性基 團(tuán)；有機(jī)磷農(nóng)藥分子大都含有=S、一0R、一P、一0-、一C1、或一P = 0等電負(fù)性基團(tuán)；而近年 來開發(fā)的新型農(nóng)藥中大多含有一F基團(tuán)，因此，使用GC-NCI-MS可方便實(shí)現(xiàn)多種農(nóng)藥的多殘 留分析，與GC-EI-MS相比，能獲得更好的抗干擾能力、更低的靈敏度和更好的選擇性，但迄 今為止未見食品農(nóng)產(chǎn)品中氟唑菌酰胺殘留量的GC-NCI-MS檢測方法的報道。另外，眾所周 知，QuEChERS前處理技術(shù)已成為農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用最廣的樣品前處理方法，但QuEChERS 方法主要適用于低脂肪含量的高含水基質(zhì)，如大部分的水果蔬菜，在面對高脂肪含量基質(zhì) 時能力有限，一般需要增加正己烷除脂、冷凍樣品提取液去脂等步驟，但效果有限。近年來 有些公司推出了增強(qiáng)型脂質(zhì)去除專利產(chǎn)品-Enhanced Matrix Removal，EMR_lipid，主要用 于去除具有直鏈烴類結(jié)構(gòu)的脂類干擾物，包括游離脂肪酸、膽固醇、甘油三酯、磷脂等。該產(chǎn) 品已被制成基質(zhì)固相分散萃取劑，經(jīng)水活化后可直接通過分散固相萃取流程對提取液中的 脂類雜質(zhì)進(jìn)行去除，本發(fā)明應(yīng)用該前處理方法凈化動物源性食品時發(fā)現(xiàn)，該方法簡單高效、 對脂類物質(zhì)去除效果好，建立EMR基質(zhì)分散凈化、氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源-質(zhì)譜(GC-NCI-MS)定性和定量分析動物源性食品中氟唑菌酰胺殘留量的檢測方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種動物源性食品中氟唑菌酰胺殘留的快速測定方法，主要 用于測定動物源性食品等脂肪含量高的食品農(nóng)產(chǎn)品中氟唑菌酰胺殘留量。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種動物源性食品中氟唑菌酰胺 殘留的快速測定方法，包括如下步驟：
[0008] (1)提取 稱取混勻樣品于具塞離心管中，加入適量水復(fù)蘇后，定量加入乙腈溶液均質(zhì)提取，然后 加入氯化鈉和無水硫酸鎂，劇烈渦旋lmin后離心。
[0009] 凈化 將增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品EMR用水活化，移取樣品提取液于活化好的EMR凈化管中，禍旋 lmin后，7000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移全部上清液至裝有無水硫酸鎂和氯化鈉的離心管中進(jìn)行 鹽析，渦旋離心后，移取一定體積的上清液，濃縮至干后，用體積比為1/1的丙酮/正己烷混 合溶劑溶解定容，過膜后，待氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源-質(zhì)譜(GC-NCI-MS)檢測。
[0010] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 將不含氟唑菌酰胺的同種類基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，得樣品提取凈化 殘渣，加入適量溶劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，配制成至少3個濃度的氟唑菌酰胺系列標(biāo)準(zhǔn)工 作液。
[0011] (4)測定和結(jié)果計算 將步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行GC-NCI-MS測定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰 面積對其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟(2)中凈化 后的樣品液注入GC-NCI-MS進(jìn)行測定，測得樣品液中氟唑菌酰胺的色譜峰面積，代入基質(zhì)標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線，得到樣品液中氟唑菌酰胺含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計算得到 樣品中氟唑菌酰胺殘留量;若上機(jī)溶液中氟唑菌酰胺殘留量超過線性范圍上限，需用定容 溶劑將上機(jī)溶液濃度稀釋至線性范圍之內(nèi)。
[0012] 步驟(1)中樣品若為動物肝臟等含水量較少的樣品，提取前須加適量水充分浸潤。
[0013] 步驟(4)中氣相色譜條件為:色譜柱:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，柱長30m，內(nèi)徑0.25mm， 膜厚0.25μπι;進(jìn)樣口溫度250°C ;載氣：He，不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量：lyL;恒流模式，流速 1. OmL/min;升溫程序:初溫60°C保持2min，以每分鐘20°C的速度升至200°C，然后以每分鐘2 °C的速度升至220°C，再以每分鐘20°C的速度升至280°C，保持lOmin;傳輸線溫度:280°C。
[0014] 步驟(4)中質(zhì)譜條件為:離子源溫度150°C;四極桿溫度150°C;電離模式:負(fù)化學(xué)電 離，即NCI模式，能量70eV;掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM)模式，監(jiān)測的離子為：361.1、 362.U362.9〇
[0015] 步驟(4)中測定樣液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時，若樣液中農(nóng)藥色譜峰保留時間與標(biāo) 準(zhǔn)溶液中相應(yīng)農(nóng)藥保留時間相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均 出現(xiàn)，而且離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子豐度比相一致，則可判斷樣液中存在這種農(nóng)藥;若 上述兩個條件不能同時滿足，則判斷不含該種農(nóng)藥。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 本發(fā)明利用分散固相萃取技術(shù)，建立了簡便、快速并能有效避免樣品中基質(zhì)干擾 的樣品前處理方法，將此前處理方法結(jié)合GC-NCI-MS應(yīng)用于糧谷、動物源性食品中氟唑菌酰 胺定性確證和定量檢測，平均回收率為86.7%~93.8%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.0% ~7.8%，檢出限低于2.46yg/kg，具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。 能滿足美國、歐盟、日本等國家對相應(yīng)產(chǎn)品安全檢測的技術(shù)要求，為保障我國人民食品安全 及對外出口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0018] 圖1為添加在空白豬肉基質(zhì)中的氟唑菌酰胺的GC-NCI-MS選擇離子色譜圖。