圖像式細(xì)胞儀的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及通常在低光學(xué)放大倍率下，用于圖像式細(xì)胞術(shù)分析的方法和系統(tǒng)，其中分 析是基于生物顆粒的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】 顯微鏡用于生物材料的分析已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間。為了在顯微鏡下看到物體，必要的是該物 體顯示出不同于背景的光學(xué)特性的光學(xué)特性并且該差異被稱(chēng)為對(duì)比度。生物顆粒通常主要 是由包含在細(xì)胞膜中的水組成，這使得它們固有地與其周?chē)h(huán)境相似。細(xì)胞內(nèi)部通常與周 圍液體在某些化學(xué)組成如蛋白質(zhì)、DNA和RNA上有差異，它們中的一些形成其尺寸可能被可 視化的"結(jié)構(gòu)"，例如包裝到細(xì)胞核中的DNA。生物顆粒，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌都相 對(duì)較小，通常直徑小于約20μπι，這會(huì)使得難以在顯微鏡下觀看它們，除非應(yīng)用一些高級(jí)技 術(shù)。這樣的技術(shù)有高放大倍率、相差和UV顯微鏡并且隨著引入數(shù)字技術(shù)，已引入了幾種圖像 增強(qiáng)技術(shù)。 高放大倍率顯微鏡通常使用50倍以上的放大倍率，這使得能夠分離微小結(jié)構(gòu)，而有助 于生物顆粒的可視化和鑒定。相差顯微鏡利用折射率的小差異，產(chǎn)生具有高對(duì)比度的圖像。 UV顯微鏡利用蛋白質(zhì)和DNA的吸收特性，它們分別在約260和280nm吸收光。光的吸光度在顯 微鏡中被看作對(duì)比度。進(jìn)一步地，相比利用更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光可能分離的結(jié)構(gòu)，短波長(zhǎng)的光使得 能夠分離更小的結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)轱@微鏡的最大分辨率是取決于光的波長(zhǎng)。在生物顆粒中的 這種小結(jié)構(gòu)典型地是細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，例如核。 在通過(guò)圖像式細(xì)胞儀來(lái)評(píng)估生物顆粒中，最重要的是知曉生物顆粒在圖像中的位置。 這在分析生物顆粒的任務(wù)是計(jì)算(enumeration)在樣品中的顆粒時(shí)當(dāng)然是顯而易見(jiàn)的，而 這在關(guān)注樣品和/或細(xì)胞的其它特性的幾乎所有評(píng)估的情況下亦是如此。在圖像中鑒定任 何物體的必要條件是能夠建立使物體的圖像與周?chē)尘暗膱D像有顯著差異的條件。 典型的顯微鏡方法是基于不會(huì)改變光的波長(zhǎng)的光學(xué)特性，例如折射率、反射率或衰減 的差異，而諸如熒光顯微鏡的方法是基于光的波長(zhǎng)的偏移，典型地由物質(zhì)的量子力學(xué)特性 所帶來(lái)。 在顯微鏡中，這種差異一般被稱(chēng)為"對(duì)比度"。有幾種方法在顯微鏡中產(chǎn)生對(duì)比度，兩種 基本方法是暗場(chǎng)(DF)和明場(chǎng)(BF)顯微鏡，這里的"場(chǎng)"信號(hào)的強(qiáng)度指的是背景的強(qiáng)度，所述 背景也就是分離可能存在的任何物體的圖像的區(qū)域。因此，在DF中，背景是暗的并且物體具 有較高的強(qiáng)度，這與背景是發(fā)光的且物體的圖像表示光減少的BF相反。 當(dāng)考慮生物顆粒如生物細(xì)胞的顯微鏡分析時(shí)，DF和BF顯微鏡方法兩者都造成對(duì)比度相 當(dāng)差的圖像。因此存在著廣泛用于生物顆粒分析的額外技術(shù)，因?yàn)樗鼈兺ǔＬ峁﹫D像的更 大對(duì)比度，例如相差和熒光顯微鏡。這兩種方法當(dāng)實(shí)施用于鑒定生物顆粒時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)。相 差顯微鏡需要專(zhuān)門(mén)的光學(xué)部件，而熒光顯微鏡受到因所用熒光團(tuán)體系而限定的選擇性的限 制，該熒光團(tuán)或者必須存在于顆粒中或者結(jié)合到顆粒上。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單、有效且可靠的方法，以相當(dāng)大的對(duì)比度記錄生物顆粒的圖像，這 使得根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)特別適合于在圖像式細(xì)胞儀（Image Cytometry)中鑒定顆 粒。 本發(fā)明提供一種圖像式細(xì)胞儀，包括： -第一光源，配置為向樣品區(qū)發(fā)射光； -聚焦裝置，用于形成準(zhǔn)直光并引導(dǎo)來(lái)自第一光源的、沿所述細(xì)胞儀的光軸的準(zhǔn)直光； -第二光源，包括用于向樣品區(qū)發(fā)射激發(fā)光的第一激發(fā)光源;和 -圖像形成裝置，用于在檢測(cè)元件陣列上形成至少一部分的樣品區(qū)的圖像，其中 樣品區(qū)位于聚焦裝置和檢測(cè)元件陣列之間，并且其中 細(xì)胞儀能夠配置成在明場(chǎng)模式、暗場(chǎng)模式和熒光模式之間進(jìn)行交換，和/或其中 第一光源配置為發(fā)射波長(zhǎng)小于400nm的光，和/或其中 激發(fā)光相對(duì)于光軸具有一入射角以提供熒光模式。 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于圖像式細(xì)胞儀的照明系統(tǒng)，包括： -配置為發(fā)射光的第一光源； -聚焦裝置，用于引導(dǎo)來(lái)自第一光源的、沿著圖像式細(xì)胞儀的光軸并進(jìn)入樣品區(qū)的光； 和 -第二光源，包括配置為發(fā)射激發(fā)光并進(jìn)入樣品區(qū)的第一激發(fā)光源，其中 來(lái)自第一光源的光配置為發(fā)射波長(zhǎng)小于400nm的光。 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于評(píng)估生物樣品的至少一個(gè)數(shù)量參數(shù)和/或一個(gè)質(zhì)量 參數(shù)的方法，包括： -將一定體積的生物樣品施加到具有限定曝光區(qū)域的平行壁部的樣品室中，所述壁部 允許來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求1-51的圖像式細(xì)胞儀的光穿過(guò)樣品室的壁部， -用來(lái)自第一光源的光照明樣品室，并將穿過(guò)樣品室的光曝光到有源檢測(cè)元件的2維陣 列上，從而記錄空間光強(qiáng)度信息的圖像， -用來(lái)自第二光源的激發(fā)光照明樣品室，并將穿過(guò)樣品室的熒光曝光到有源檢測(cè)元件 的2維陣列上，從而記錄熒光空間光強(qiáng)度信息的圖像， -以使得來(lái)自個(gè)體生物顆粒的光強(qiáng)度信息被鑒定為與來(lái)自背景的光強(qiáng)度信息不同的方 式來(lái)處理兩個(gè)圖像， -以及將處理結(jié)果與生物樣品中的生物顆粒的至少一個(gè)數(shù)量參數(shù)和/或質(zhì)量參數(shù)相關(guān) 聯(lián)。
【附圖說(shuō)明】 圖1繪示出根據(jù)本發(fā)明的圖像式細(xì)胞儀的實(shí)施方式。 圖2A示出圖表，繪示出觀察到的對(duì)比度。 圖2B-G繪示出使用不同波長(zhǎng)的光所記錄的明場(chǎng)圖像。 圖3繪示出傾斜光源的布置以及掩蔽光的效果。 圖4示出曲線圖，繪示出熒光聚合物珠的強(qiáng)度。 圖5繪示出在明場(chǎng)圖像中無(wú)源光調(diào)制的構(gòu)造。
【具體實(shí)施方式】 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式的圖像式細(xì)胞儀的一個(gè)第一作用是，該圖像式細(xì)胞儀能夠被構(gòu)造成 在明場(chǎng)模式、暗場(chǎng)模式和熒光模式之間進(jìn)行交換。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，第一光源可 提供明場(chǎng)光源和暗場(chǎng)光源，使得對(duì)于明場(chǎng)模式和暗場(chǎng)模式只需要單一光源。因此，可以通過(guò) 交換裝置來(lái)獲得兩種模式之間的交換而不用改變光源或光學(xué)裝置。優(yōu)選地，第一光源被配 置用于發(fā)射波長(zhǎng)小于400nm的光。在這方面，第一光源可被視為紫外(UV)明場(chǎng)光源。業(yè)已發(fā) 現(xiàn)，使用UV明場(chǎng)光源的作用是，相比于用來(lái)自發(fā)射波長(zhǎng)大于400nm的光的光源的光所記錄的 圖像，這樣的照明提供了有關(guān)顆粒的更多細(xì)節(jié)，和/或更高的圖像對(duì)比度。 根據(jù)本發(fā)明，第二光源可提供熒光模式，并且本發(fā)明的作用是，可以無(wú)需移動(dòng)第二光源 或可引導(dǎo)來(lái)自第二光源的熒光的部件來(lái)提供熒光模式。換言之，可以快速提供熒光模式，因 為熒光光源可能不移動(dòng)或可引導(dǎo)熒光光源的部件可能不移動(dòng)。優(yōu)選地，激發(fā)光相對(duì)于光軸 具有一入射角，圖像式細(xì)胞儀的光軸由樣品區(qū)和檢測(cè)元件陣列之間的軸所限定，從而提供 熒光模式。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這樣的設(shè)置的一個(gè)作用是可以顯著降低在檢測(cè)元件上暴露的激發(fā)光 的強(qiáng)度。 衰減裝置和調(diào)制裝置 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，圖像式細(xì)胞儀進(jìn)一步包括衰減裝置，例如光學(xué)濾光器以 衰減一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波帶的光強(qiáng)度，優(yōu)選其中衰減裝置放置在沿著光軸的預(yù)定平面。甚至 進(jìn)一步地，圖像式細(xì)胞儀可進(jìn)一步包括調(diào)制裝置，例如空間調(diào)制裝置，優(yōu)選其中調(diào)制裝置放 置在沿著光軸的預(yù)定平面。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，衰減裝置和/或調(diào)制裝置是放置在 第一光源和樣品區(qū)之間的光路中。優(yōu)選地，衰減裝置和/或調(diào)制裝置是放置在樣品區(qū)和檢測(cè) 元件陣列之間的光路中。更優(yōu)選地，調(diào)制裝置放置在準(zhǔn)直光沿著光軸朝檢測(cè)元件透射通過(guò) 樣品區(qū)的焦平面中或接近該焦平面。 業(yè)已發(fā)現(xiàn)，將調(diào)制裝置放置在準(zhǔn)直光透射通過(guò)樣品區(qū)的焦平面中或接近該焦平面有很 多作用。首先，對(duì)比度，例如在高空間頻率時(shí)的對(duì)比度，相對(duì)于在這個(gè)位置沒(méi)有調(diào)制裝置的 布置得以改進(jìn)。其次，由于準(zhǔn)直光的焦平面可以是圖像形成器件的孔徑光闌，該調(diào)制裝置可 以產(chǎn)生擴(kuò)大的景深。第三，調(diào)制裝置可以允許樣品區(qū)中僅被樣品顆粒折射或分散的光到達(dá) 檢測(cè)元件，并消除從光源直接發(fā)射的光。通過(guò)調(diào)制裝置放置在準(zhǔn)直光透射通過(guò)樣品區(qū)的焦 平面或接近該焦平面的布置，可能簡(jiǎn)單地通過(guò)放置或移除適當(dāng)?shù)恼{(diào)制器而實(shí)現(xiàn)具有記錄高 對(duì)比度明場(chǎng)或暗場(chǎng)圖像或這兩者組合的靈活性的圖像式細(xì)胞儀。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，兩個(gè)或更多個(gè)衰減裝置和/或調(diào)制裝置是安裝在交換裝 置中，其允許移除或交換衰減裝置和/或調(diào)制裝置。交換裝置可以例如包括旋轉(zhuǎn)單元，例如 濾光輪。兩個(gè)或更多個(gè)交換裝置可以是使得衰減和/或調(diào)制裝置中沒(méi)有一個(gè)、一個(gè)、兩個(gè)或 更多個(gè)可以在同一時(shí)間沿光軸定位。具有兩個(gè)或更多個(gè)交換裝置的作用可以是這些允許調(diào) 制裝置、衰減裝置或兩種裝置的組合效應(yīng)。另一個(gè)作用可以是相比具有相同數(shù)量的衰減裝 置和/或調(diào)制裝置的單交換裝置，兩個(gè)或更多個(gè)交換裝置可以更迅速地交換衰減裝置和/或 調(diào)制裝置，例如，因?yàn)檫@種交換裝置可以更小，并能比單交換裝置旋轉(zhuǎn)更快。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)調(diào)制裝置可以是部分不透明的或部分透明的。 衰減和/或調(diào)制裝置同樣可以是在一些部分是部分不透明的而在與之不同的部分是部分透 明的，優(yōu)選地，其中所述部分中一個(gè)或多個(gè)是圓形的。因此，至少有一個(gè)調(diào)制裝置的一部分 可以是部分不透明的并且該調(diào)制裝置的另一部分可以是部分透明的。優(yōu)選地，衰減裝置可 使光衰減預(yù)定的系數(shù)，例如小于10- 3,例如小于ΚΓ4,例如小于10-5或例如小于ΚΓ6。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)制裝置包括配置用于暗場(chǎng)模式的障礙物，優(yōu)選基本上 衰減穿過(guò)樣品區(qū)的準(zhǔn)直光。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)制裝置包括配置用于明場(chǎng) 模式的孔，優(yōu)選基本上衰減從樣品區(qū)發(fā)射的非準(zhǔn)直光。通過(guò)交換障礙物和孔，能實(shí)現(xiàn)明場(chǎng)模 式和暗場(chǎng)模式之間的交換的可能性。明場(chǎng)模式和暗場(chǎng)模式之間的交換可因此通過(guò)調(diào)制裝置 來(lái)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地通過(guò)插入和/或交換位于樣品區(qū)和檢測(cè)元件陣列之間的調(diào)制裝置。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)制裝置包括相差顯微鏡調(diào)制裝置。因此，調(diào)制裝置 可以構(gòu)成相差顯微鏡調(diào)制裝置并且由第一光源發(fā)射的光的實(shí)質(zhì)波長(zhǎng)為窄波段，優(yōu)選其中的 波段寬度小于50nm〇 第一和第二光源 在光學(xué)設(shè)置中，可以接受的是不總能夠獲得完全準(zhǔn)直，并且來(lái)自第一光源的準(zhǔn)直光可 以與準(zhǔn)直光偏離小于10度，更優(yōu)選小于5度的偏離角。 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，來(lái)自第一光源的波長(zhǎng)是介于200nm和700nm之間。優(yōu)選地，來(lái)自 第一光源的波長(zhǎng)可以是介于300nm和395nm之間。甚至更優(yōu)選地，來(lái)自第一光源的波長(zhǎng)可以 是介于320nm和380nm之間。最優(yōu)選地，來(lái)自第一光源的波長(zhǎng)可以是介于350nm和380nm之間。 來(lái)自第二光源的激發(fā)光可以具有與來(lái)自第一光源的光的波長(zhǎng)實(shí)質(zhì)上不同的波長(zhǎng)。優(yōu)選 地，激發(fā)光的入射角可介于10和80度之間，優(yōu)選介于20和60度之間，并且更優(yōu)選介于30至50 度之間?？商娲?，激發(fā)光的入射角可以是90度。在本發(fā)明的另一替代的實(shí)施方式中，入射 角是介于110至180度之間，優(yōu)選介于120和160度之間，并且更優(yōu)選介于130和150度之間。 聚焦裝置 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，聚焦裝置包括透鏡，而在本發(fā)明的另一同樣優(yōu)選的實(shí)施 方式中，聚焦裝置包括曲面鏡。 額外的光源 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，圖像式細(xì)胞儀進(jìn)一步包括額外的光源，例如第三或第四 或第五或第六光源，優(yōu)選地所述額外的光源是激發(fā)光源。所述光源可以是發(fā)光二極管和/或 二極管激光器和/或激光器，例如可調(diào)諧式固態(tài)光源和/或可調(diào)諧式發(fā)光二極管。可調(diào)諧式 固態(tài)光源可以是可調(diào)諧式激光二極管。 光學(xué)裝置和檢測(cè)元件 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，光源是光學(xué)連接到光學(xué)裝置，所述光學(xué)裝置配置成在整 個(gè)樣品區(qū)和/或在整個(gè)由檢測(cè)元件陣列所成像的區(qū)域提供具有基本上均勻強(qiáng)度的光。光學(xué) 裝置可包括微透鏡陣列?？商娲兀鈱W(xué)裝置可包括柱面微透鏡陣列，優(yōu)選地可包括與柱面 透鏡大致垂直取向的兩個(gè)柱面微透鏡陣列。檢測(cè)元件陣列可以是CCD或CMOS傳感器元件的 陣列。 曝光 根據(jù)本發(fā)明，光源是配置為發(fā)射光的持續(xù)時(shí)間小于1秒，優(yōu)選地為小于0.1秒。優(yōu)選地， 光源是配置為發(fā)射光的持續(xù)時(shí)間介于〇. 0001和〇. 1000秒之間，優(yōu)選介于〇. 0001和〇. 0500秒 之間。然而，在某些情況下，例如當(dāng)在熒光成像時(shí)需要高靈敏度時(shí)，光源可配置為發(fā)射光的 持續(xù)時(shí)間超過(guò)1秒，例如超過(guò)2秒，例如超過(guò)3秒，例如超過(guò)4秒，例如超過(guò)5秒，例如超過(guò)6秒， 例如超過(guò)7秒，例如超過(guò)8秒，例如超過(guò)9秒或例如超過(guò)10秒。 遮光 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過(guò)選擇性地移除來(lái)自激發(fā)光的光束的光線，基本 上消除來(lái)自激發(fā)光源的、到達(dá)圖像形成裝置的入口的光。光線可以通過(guò)在激發(fā)光的光束中 放置一個(gè)或多個(gè)障礙物來(lái)選擇性地移除，優(yōu)選地其中激發(fā)光的光束在障礙物所放置的平面 中基本上是準(zhǔn)直的。 圖像形成裝置 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，圖像形成裝置配置為提供超過(guò)5μπι的景深，例如介于ΙΟμπι 和150μπι之間。以這種方式，樣品區(qū)可在景深中呈焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)使得可以不需要為了在樣品區(qū)中 獲取清晰的樣品圖像而移動(dòng)圖像形成裝置和/或檢測(cè)元件陣列，例如當(dāng)樣品中的顆粒定位 在不同深度時(shí)。然而，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，圖像形成裝置和/或檢測(cè)元件陣列和/或 樣品室可以配置為使得圖像形成裝置和/或檢測(cè)元件陣列可相對(duì)于樣品被放置在最佳位置 而移動(dòng)。一個(gè)樣品或樣品的一部分可以是，例如在一種配置中是呈焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的，但當(dāng)改變到 另一個(gè)樣品或樣品的不同部分時(shí)，該另一個(gè)樣品或樣品的不同部分則可以不是焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn) 的，并且因此需要或者移動(dòng)樣品和/或圖像形成裝置和/或檢測(cè)元件陣列。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，圖像形成裝置配置為透射在介于200nm和lOOOnm之間的 波長(zhǎng)區(qū)域的光，更優(yōu)選在介于350nm和lOOOnm之間的波長(zhǎng)區(qū)域，更優(yōu)選在介于350nm和850nm 之間的波長(zhǎng)區(qū)域。 在本發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，圖