039] (1)探針溶液:稱取2.8 mg的探針（分子式：CnHuNOs分子量：279.09)，用乙腈溶 解，配制成1 OOmL溶液，濃度為1 ΟΟμΜ。
[0040] (2)Tris-HCl緩沖溶液：用濃度為50 mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)和50mM的HC1配 制，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至所需； (3) HEPES -NaOH緩沖溶液：用濃度為50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)和50mM的NaOH 配制，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至所需； (4) 其它共存離子、分子溶液:取分析純的各種金屬的硝酸鹽或高氯酸鹽，用二次蒸餾 水溶解，并配制成濃度為20mM的二次蒸餾水溶液;取分析純的各種氨基酸、牛血清蛋白、牛 血紅蛋白和D-果糖用二次蒸餾水溶解，并配制成濃度為50mM的二次蒸餾水溶液。
[0041 ]本發(fā)明所用紫外-可見分光光度計(jì)型號(hào)為UV-1800,日本島津公司公司生產(chǎn)；焚光 分光光度計(jì)型號(hào)為Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，美國VARIAN公司生產(chǎn)，酸度計(jì)型號(hào)為奧 立龍818,美國奧立龍(Orion)公司生產(chǎn)。
[0042]實(shí)施例二:探針化合物的制備。
[0043]以8-羥基喹哪啶，2,4_二羥基苯甲醛為原料，分別以乙酸酐，吡啶/水為溶劑，首先 合成中間體，再由中間體在吡啶/水的混合溶劑中水解得，合成路線如下：
三口燒瓶中，在溶有8-羥基喹哪啶的乙酸酐溶液中，加入2,4_二羥基苯甲醛，按摩爾比 8-羥基喹哪啶：2,4_二羥基苯甲醛等于1:2,氮?dú)獗Ｗo(hù)下，回流，反應(yīng)結(jié)束，濃縮除去溶劑乙 酸酐，經(jīng)硅膠柱層析洗脫，得到中間體。反應(yīng)溫度：139°C(回流），反應(yīng)時(shí)間：5h，反應(yīng)溶劑：乙 酸酐，洗脫劑:體積比氯仿：乙酸乙酯(3:1)。
[0044] N2保護(hù)下，三口燒瓶中加入中間體，吡啶為溶劑，加熱回流反應(yīng)，冷卻，加入水使吡 啶和水的體積比為3:1，繼續(xù)回流，反應(yīng)結(jié)束，加入水萃取，干燥，過濾，硅膠柱層析分離和洗 脫，得探針化合物。反應(yīng)溫度：1 〇〇°C，反應(yīng)時(shí)間：12h，反應(yīng)溶劑:吡啶:水(3:1)，洗脫劑:體積 比氯仿：甲醇(9:1)。
[0045]實(shí)施例三:pH探針的光譜測定。
[0046] 在10.0 mL容量瓶中加入探針的乙腈儲(chǔ)備液(0.1mM，lmL)，分別加入不同pH值的 Tri s-HCl或HEPES-NaOH緩沖溶液，使測試溶液的溶劑比為乙腈/緩沖溶液(v/v，3/2 )，稀釋 至刻度，搖勻，移入lcm的石英比色皿進(jìn)行熒光光譜和紫外-可見吸收光譜測定。熒光光譜測 定的最大激發(fā)波長為440nm，最大發(fā)射波長分別為550nm或580nm〇
[0047] (1)熒光光譜法對(duì)pH的檢測 在1 cm的比色皿中，加入濃度為1 ΟμΜ的探針溶液，再分別加入pH為1.6、1.8、2.0、2.2、 2.4、 2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4的1^8-!1(：1緩沖 溶液，使測試溶液的溶劑比為（乙腈/Tris-HCl，v/v，3/2)。將溶液進(jìn)行光譜測定，探針在 550nm處的熒光強(qiáng)度隨pH增大線性增加[如圖1 (A)]。將最大熒光強(qiáng)度對(duì)pH值作圖，如圖1 (A)中的插圖。最大激發(fā)波長為440 nm〇
[0048] 在lcm的比色皿中，加入濃度為1 ΟμΜ的探針溶液，再分別加入pH為9.0、10.0、10.2、 10.4、 10.6、10.8、11.0、11.2、11.4)的HEPES-NaOH緩沖溶液，使測試溶液的溶劑比為（乙腈/ HEPES-NaOH，v/v，3/2)。將溶液進(jìn)行光譜測定，探針在550nm處的熒光強(qiáng)度隨pH增大線性增 加[如圖2(A)]。將熒光強(qiáng)度對(duì)pH值作圖，如圖2(A)中的插圖。最大激發(fā)波長為440 nm。
[0049] 在1 cm的比色皿中，加入濃度為1 ΟμΜ的探針溶液，再分別加入pH為11.4、11.6、 11.8、12.0、12.2、12.4的HEPES-NaOH緩沖溶液，使測試溶液的溶劑比為（乙腈/HEPES-NaOH， v/v，3/2)。將溶液進(jìn)行光譜測定，探針在580nm的熒光強(qiáng)度隨pH增大線性降低[如圖2(B)]。 將熒光強(qiáng)度對(duì)pH值作圖如，圖2(B)中的插圖。最大激發(fā)波長為440 nm。
[0050] 通過以上光譜測定，得到探針熒光法檢測不同pH的溶液分別在550nm和580nm處的 熒光強(qiáng)度與pH值的校正曲線[如圖4(A)、（C)、（D)]。
[0051]
在濃度為1 〇μΜ的探針溶液中，用乙腈/Tri s-HCl緩沖溶液(v/v，3/2 )控制探針溶液pH為 3.6,測定550 nm處的熒光強(qiáng)度;再分別加入Na2+，Ca2+，Zn2+(10 mM)，K+，Mg2+(2 mM)，Ni2+(30 mM)，Ba2+，Pb2+，Ag+(0.5 mM)，Al3+，F(xiàn)e3+，Hg2+(10 m M)，Cu2+(20 mM);賴氨酸（0.1 mM)，半胱 氨酸，谷氨酸，色氨酸，酪氨酸，牛血清蛋白，牛血紅蛋白，果糖（1 mM)，精氨酸(0.2 m M)作 為共存金屬離子、分子，再測定探針溶液在550nm處的熒光強(qiáng)度，考察共存離子、分子對(duì)探針 檢測pH的影響，結(jié)果如圖7(A)。探針溶液檢測pH的熒光強(qiáng)度不受上述金屬離子、分子共存的 干擾。最大激發(fā)波長為440 nm〇
[0052] 在濃度為ΙΟμΜ的探針溶液中，用乙腈/HEPES-NaOH (v/v，3/2,）緩沖溶液控制探針 溶液口!1為10.6，測定580 11111處的熒光強(qiáng)度;再分別加入他2+(10 11^)，0&2+，48+(0.2 1111)，2112+ (20 mM)，K+，Mg2+(2 mM)，F(xiàn)e3+(50 mM)，Ni+，Ba2+，Hg2+(0.1 mM)，Al3+，Pb2+，Cu2+(10 mM);賴氨 酸(0.2 mM)，谷氨酸(0.5 mM)，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，絡(luò)氨酸，牛血清蛋白，牛血紅蛋 白，果糖（1 mM)，作為共存金屬離子、分子，再測定探針溶液在580 nm處的熒光強(qiáng)度，考察共 存離子、分子對(duì)探針檢測pH的影響，結(jié)果如圖7(B)。探針溶液檢測pH的熒光強(qiáng)度不受上述金 屬離子、分子共存的干擾。最大激發(fā)波長為440 nm。
[0053] (2)紫外-可見吸收光譜法對(duì)pH的檢測 在1 cm的比色皿中，加入濃度為1 ΟμΜ的探針溶液，再分別加入pH為1.6、1.8、2.0、2.2、 2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0的1^8-!1(：1緩沖溶液，使 測試溶液的溶劑比為（乙腈/1^8-!1(：1，7八，3/2)。將溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜測定，探 針在430nm處的吸光度隨pH增大線性增加[如圖1(B)]。將吸光度對(duì)pH值作圖，如圖1(B)中 的插圖。
[0054] 在1 cm的比色皿中，加入濃度為ΙΟμΜ的探針溶液，再分別加入pH為5.0、6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0的HEPES-NaOH緩沖溶液，使測試溶液的溶劑比為（乙腈/HEPES-NaOH，v/v，3/ 2)。將溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜測定，探針在360nm處的吸光度隨pH增大線性增加[如圖 2(C)]。將吸光度對(duì)pH值作圖，如圖2(C)的插圖。
[0055] 通過以上光譜測定，得到探針檢測不同pH的溶液分別在430nm和360nm處的吸光度 與pH值的校正曲線[如圖4(B)、（E)]。
[0056] 休訂的災(zāi)冗冗7T大過程
濃度為10 mM的探針溶液（乙腈/!^8-!1(：1，￥八，3/2)，用1^8-!1(：1(5〇1111)調(diào)節(jié)其?!1為 2.0，測定其熒光光譜和強(qiáng)度;然后再用Tris-HCl調(diào)節(jié)探針的pH為7.0，再測定其熒光光譜和 強(qiáng)度;如此反復(fù)，連續(xù)改變?nèi)芤簆H為2.0或7.0，得到六次循環(huán)的光譜變化[如圖5(A)。熒光 強(qiáng)度與pH變化的循環(huán)過程如圖5(A)插圖。激發(fā)和發(fā)射波長為440/550nm。
[0057] 濃度為 10 mM的探針溶液（乙腈/HEPES-Na0H，v/v，3/2)，用HEPES-Na0H(50mM)調(diào)節(jié) 其pH值為7.0，測定其熒光光譜和強(qiáng)度;然后再用HEPES-NaOH調(diào)節(jié)探針的pH值為11.4，再測 定其熒光光譜和強(qiáng)度;如此連續(xù)改變?nèi)芤簆H為7.0或11.4，得到六次循環(huán)的光譜變化[如圖 5(B)]。熒光強(qiáng)度與pH變化的循環(huán)過程如圖5(B)插圖。p