一種揭示藥物活性成分及其組合的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及一種揭示藥物活性成分及及其組合，尤其涉及一種從 丹七方中發(fā)明在抑制凝血酶方面具有聯(lián)合用藥價(jià)值的藥物組合。
【背景技術(shù)】
[0002] 中草藥發(fā)展歷史悠久，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)相傳或古籍記載流傳至今。而中藥復(fù)方，作為配伍 規(guī)律的具體應(yīng)用形式，具有豐富奧妙的科學(xué)內(nèi)涵和組合變化規(guī)律。近幾十年來(lái)，隨著高通量 篩選技術(shù)的崛起，很多中外學(xué)者把研究興趣放在從草藥中篩選具有潛力的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)或新的 活性分子。然而，有個(gè)不可忽略的事實(shí)是中藥里成分復(fù)雜多樣、含量層次不齊，為新藥篩選 帶來(lái)了極大的麻煩。因此，從篩選化合物庫(kù)的角度，在篩選之前對(duì)中藥提取物進(jìn)行必要的改 造和優(yōu)化是影響后續(xù)活性化合物篩選的重要因素。
[0003] 而另一方面，西藥"單一藥物作用于單一靶點(diǎn)"的藥物作用模式對(duì)中藥研究造成了 極大的沖擊:很多中藥研究工作過(guò)分關(guān)心某一個(gè)單體成分，忽視了中藥藥效是在中醫(yī)指導(dǎo) 下的多成分整合作用的結(jié)果。目前專門針對(duì)中藥多成分組合相互作用的篩選方法或理論少 之又少。如何揭示中藥尤其是中藥復(fù)方所包含的多成分組合產(chǎn)生的相互作用，對(duì)于中藥研 究及現(xiàn)代化具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] (一)要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0005] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于:建立一種基于化學(xué)家族分類和天然化合物庫(kù)優(yōu)化的既 能快速、準(zhǔn)確辨識(shí)其生物活性小分子，又能全面揭示多成分間相互作用關(guān)系的篩選方法。
[0006] (二)技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明涉及一種揭示藥物活性成分及其組合的方法，該方法包括如下步驟：
[0008] 步驟1:對(duì)藥物提取物進(jìn)行色譜分離和化合物結(jié)構(gòu)鑒定，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性將化合物 分成不同的化學(xué)家族。
[0009] 步驟2:對(duì)色譜圖進(jìn)行分解并逐個(gè)收集每個(gè)色譜峰的餾分，記錄其色譜峰面積。
[0010] 步驟3:從每個(gè)化學(xué)家族中選擇一個(gè)容易獲取的化合物作為代表，測(cè)試記錄各代表 在同一濃度的色譜峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)化學(xué)家族中的其他化合物以重新組合的方式向該 標(biāo)準(zhǔn)看齊，對(duì)天然化合物庫(kù)改造。
[0011] 步驟4:應(yīng)用高通量篩選技術(shù)對(duì)改造后的天然化合物庫(kù)進(jìn)行掃描并找到活性化合 物。
[0012] 步驟5:圍繞活性化合物所在的化學(xué)家族，選用指標(biāo)或模型評(píng)價(jià)家族內(nèi)和家族間組 合的多成分相互作用關(guān)系，這種關(guān)系可能是拮抗、相加、協(xié)同或者無(wú)明顯相互關(guān)系。
[0013] 本發(fā)明的步驟1中的藥物提取物的來(lái)源包括而不限于:植物提取物、動(dòng)物提取物、 微生物提取物、真菌提取物、礦物提取物等天然產(chǎn)物。
[0014] 本發(fā)明的步驟1中的所述結(jié)構(gòu)相似性為在結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)、藥效團(tuán)、或分子量等方面 具有的相似性。
[0015] 本發(fā)明的步驟1中的化合物結(jié)構(gòu)鑒定為基于質(zhì)譜的化合物分子量和特征碎片離子 比對(duì)或基于核磁共振技術(shù)、紅外光譜、紫外光譜的化合物結(jié)構(gòu)解析。
[0016] 本發(fā)明的步驟1中的色譜分離為分析型、半制備型或制備型的高效液相色譜。
[0017] 本發(fā)明的步驟2中的色譜圖進(jìn)行分解為通過(guò)色譜圖的保留時(shí)間設(shè)置時(shí)間窗，以色 譜峰為單位的餾分收集。
[0018] 本發(fā)明的步驟3中的容易獲取的化合物為在天然產(chǎn)物中豐度高且易制備純化的標(biāo) 準(zhǔn)品、或者市場(chǎng)上價(jià)格便宜的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0019] 本發(fā)明的步驟3中的重新組合為按照規(guī)則，通過(guò)手動(dòng)移液器或自動(dòng)化儀器對(duì)各個(gè) 餾分進(jìn)行混合。
[0020] 本發(fā)明的制備方法，步驟3中的規(guī)則是：
[0021] 本發(fā)明的步驟4中的所述高通量篩選技術(shù)為多孔道酶標(biāo)儀檢測(cè)或基于靶細(xì)胞和靶 蛋白的親和色譜篩選。
[0022] 本發(fā)明的步驟5中的指標(biāo)或模型為Combination Index理論、Bliss independence 模型、Loewe additivism模型或者劑量依賴性的相互作用趨勢(shì)。
[0023] 本發(fā)明涉及一種藥物活性成分的重新組合方法;該方法包括如下步驟：
[0024] 步驟1:對(duì)藥物提取物進(jìn)行色譜分離和化合物結(jié)構(gòu)鑒定，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性將化合物 分成不同的化學(xué)家族。
[0025] 步驟2:對(duì)色譜圖進(jìn)行分解并逐個(gè)收集每個(gè)色譜峰的餾分，記錄其色譜峰面積
[0026] 步驟3:從每個(gè)化學(xué)家族中選擇一個(gè)容易獲取的化合物作為代表，測(cè)試記錄各代表 在同一濃度的色譜峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)化學(xué)家族中的其他化合物以重新組合的方式向該 標(biāo)準(zhǔn)看齊，對(duì)天然化合物庫(kù)進(jìn)行改造。
[0027] 重新組合的具體步驟：
[0028] 假設(shè)某提取物中含有X個(gè)成分(例如18個(gè)成分），這18個(gè)成分對(duì)應(yīng)的……峰面積為 Al、A2、A3......Al8，
[0029] 根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性被分為L(zhǎng)、M、N三個(gè)化學(xué)家族：
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 從L、M、N中各選一個(gè)易于獲得標(biāo)準(zhǔn)品的化合物作為代表。測(cè)試其在某一濃度的峰 面積分別記為At、Af、A=。例如在酶活性測(cè)試時(shí)通常會(huì)選用?〇〇μΜ作為先導(dǎo)濃度以初步 判斷化合物是否具有值得深入研究的價(jià)值。趑，也' 即為各自家族成員所需用于測(cè)試活 性的量。用峰面積作為同一化學(xué)家族重新組合的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)為記錄在中國(guó)藥典和美國(guó)藥典 的一測(cè)多評(píng)方法(如下）：
[0034] 假設(shè)某一個(gè)樣品含有i個(gè)組分
[0035] Ci/Ai = fi(i = l，2, · · ·，s. · ·，k) ①
[0036] 式中仏為組分峰面積，(^為組分濃度。選取其中一組分s為內(nèi)標(biāo)，建立組分s與其他 組分間的相對(duì)校正因子：
[0037] fsk = fs/fk=(CsXAk)/(CkXAs) ②
[0038] Ck=(CsXAk)/(fskXAs) ③
[0039] 式子中As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物濃度。Ak為其他組分k的峰面積;C k為其他組 分k的濃度。當(dāng)分析物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)、吸收特性時(shí)，相對(duì)校正因子可以視為1。因此，上 述公式在同系物中可以簡(jiǎn)化為:Ck = (Cs X Ak)/As。當(dāng)代表性化合物S在某一濃度(e . g. Cs = 1 ΟΟμΜ)的峰面積(As)已知，且化合物k的峰面積(Ak)與化合物s的峰面積(As)相等，化合物k 的濃度(Ck)即等于代表化合物的濃度(Cs)。
[0040] 計(jì)算每個(gè)家族中每個(gè)色譜峰重構(gòu)所需的比例。
[0041]
[0044] 用手動(dòng)移液器或者自動(dòng)化儀器按步驟3的比例對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行組合，從而完成 對(duì)提取物的改造。
[0045] 步驟4:應(yīng)用高通量篩選技術(shù)對(duì)改造后的天然化合物庫(kù)進(jìn)行掃描并找到活性化合 物。
[0046] 步驟5:對(duì)步驟1中藥物的制備方法進(jìn)行改進(jìn)，使得步驟1中提取物中含量過(guò)少的活 性化合物的含量增加，使得驟1中提取物中因含量過(guò)大的活性化合物的含量減少，從而得到 重新組合的藥物提取物。
[0047] 本發(fā)明的效果包括:全面篩選藥物提取物中的活性成分，避免活性成分在原提取 物中含量過(guò)少而導(dǎo)致的漏篩和無(wú)活性成分因含量過(guò)大而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，使成分未知、 含量未知且參差不齊、響應(yīng)有高有低的中藥原提取物轉(zhuǎn)變?yōu)槌煞智宄?、含量相?duì)已知并且 均勻、響應(yīng)良好的篩選化合物庫(kù)，從而可以更好的與高通量篩選技術(shù)兼容。更重要的是，該 方法可以全面揭示化學(xué)家族內(nèi)和家族間組合的多成分相互作用關(guān)系，是對(duì)現(xiàn)代中藥活性成 分篩選體系的重要補(bǔ)充。
[0048] 通過(guò)本發(fā)明得到重新組合的藥物提取物，也就是如下具有活性的新的藥物組合 物。
[0049] 本發(fā)明涉及一種抑制凝血酶活性的藥物組合物，由如下丹參酮類化合物中的一 種、兩種、或多種組成;丹參酮類化合物為：15,16-二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮 IIA；
[0050] 本發(fā)明涉及一種促進(jìn)凝血酶活性的藥物組合物，由如下人參皂苷類化合物中的一 種、兩種、或多種組成;人參皂苷類化合物為:人參皂苷Rgl、人參皂苷Rhl、人參皂苷Rd、人參 皂苷Rb。
[0051] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控凝血酶活性的藥物組合物，其中包含:丹參酮類化合物、人參 皂苷類化合物;丹參酮類化合物由以下的一種、兩種、或多種組成：15，16_二氫丹參酮、隱丹 參酮、丹參酮I、丹參酮IIA;人參皂苷類化合物由以下的一種、兩種、或多種組成：人參皂苷 Rgl、人參皂苷Rhl、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb。
[0052] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控凝血酶活性的藥物組合物，其中包含:丹酚酸A、丹參酮類化 合物、人參皂苷類化合物;丹參酮類化合物由如下一種、兩種、或多種組成：15，16_二氫丹參 酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA;人參皂苷類化合物由如下一種、兩種、或多種組成:人參 皂苷Rgl、人參皂苷Rhl、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb。
[0053] 本發(fā)明涉及一種抑制凝血酶活性的藥物組合物，由丹參酮類化合物中的一種、兩 種、或多種組成;丹參酮類化合物為：