一種細(xì)菌計數(shù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于材料科學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜的 細(xì)菌計數(shù)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌菌體濃度的檢測在微生物發(fā)酵、環(huán)境監(jiān)測、食品質(zhì)量檢測等領(lǐng)域都具有重要 意義。目前，常用的細(xì)菌計數(shù)方法為培養(yǎng)法，包括平板計數(shù)法、MPN法等。
[0003] 平板計數(shù)法是檢測菌落總數(shù)的國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗法(參考文獻見:GB/T4789.2-2010 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S])，是判斷其他計數(shù)方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方 法對于平皿中的單菌落計數(shù)較準(zhǔn)確，但由于培養(yǎng)皿中菌落疏密不均勻地排列，依靠人工觀 察粘連菌落并計數(shù)具有一定的主觀性且計數(shù)不準(zhǔn)確，整體來說該方法操作繁瑣、耗時長、誤 差大、效率低。
[0004] MPN是稀釋培養(yǎng)測數(shù)法:適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理 的含少量金黃色葡萄球菌的食品。MPN法是一種常見的間接計數(shù)法，但其存在一定的局限 性。
[0005] 運些培養(yǎng)法存在耗時較長，無菌操作要求嚴(yán)格，手續(xù)繁瑣，勞動強度大，受培養(yǎng)條 件影響較大等不足。
[0006] 為克服培養(yǎng)法的不足，多種計數(shù)方法被廣泛采用。其中相對可靠并被廣泛認(rèn)可的 有巧光顯微鏡計數(shù)法和流式細(xì)胞儀計數(shù)法，其中巧光顯微鏡(Fluorescencemicroscope) 計數(shù)法:巧光顯微鏡是W紫外線為光源，用W照射被檢物體，使之發(fā)出巧光，然后在顯微鏡 下觀察物體的形狀、所在位置及其數(shù)量。流式細(xì)胞儀計數(shù)法是通過激光對通過激光束的顆 粒進行計數(shù)，當(dāng)顆?；蛘呒?xì)胞通過激光束的時候，會對光線產(chǎn)生折射和反射。運個折射和反 射的信號被探測器記錄下來。每通過一個細(xì)胞，就會產(chǎn)生一個峰值，最后記錄峰值的個數(shù)。
[0007] 雖然運兩種方法具有快速、準(zhǔn)確的特點，但存在設(shè)備昂貴，使用和維護成本高等不 足。因此，尋求一種操作簡便、快速，成本低的細(xì)菌計數(shù)方法具有重要價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種操作簡便、耗時短、成本 低的細(xì)菌計數(shù)方法，能實現(xiàn)細(xì)菌菌體濃度的快速準(zhǔn)確檢測。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種細(xì)菌計數(shù)方法，包括W下步驟：
[0010] S1:利用電聚合法在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜；
[0011] S2:繪制所述聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜修飾電極標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012] S3:根據(jù)所述步驟S2所得標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測菌液樣本的細(xì)菌濃度。
[0013] 上述方案中，所述步驟S1具體包括W下步驟：
[0014] 1)標(biāo)準(zhǔn)菌懸液準(zhǔn)備：
[0015] 配制細(xì)菌培養(yǎng)液，高壓滅菌后接種適量菌種進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)后所獲得菌液離屯、 清洗，便得到標(biāo)準(zhǔn)菌懸液；
[0016] 2)細(xì)菌在玻碳電極表面的固定：
[0017] 所述玻碳電極進行預(yù)處理后，測定其循環(huán)伏安曲線，直至氧化-還原峰電位差降至 80mVW內(nèi)，將所述玻碳電極驚干;取所述標(biāo)準(zhǔn)菌懸液滴至玻碳電極表面后，經(jīng)烘干即可將細(xì) 菌固定在所述玻碳電極表面；
[0018] 3)苯胺在電極表面的聚合：
[0019] 將上述固定有細(xì)菌的玻碳電極置于含有苯胺的硫酸溶液中采用循環(huán)伏安法掃描， 苯胺在玻碳電極表面聚合得到聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜。
[0020] 上述方案中，所述硫酸溶液為0.5M，苯胺為0.1M，循環(huán)伏安法掃描1~20圈，掃描速 率為5~lOOmV/s，電壓下限為-0.6~0V，電壓上限為0.75~1.2V。
[0021] 優(yōu)選的，所述掃描圈數(shù)為10圈，所述掃描速率為50mV/s，所述掃描的電壓范圍為-0.2~0.9V。
[0022] 上述方案中，所述步驟S2具體包括W下步驟：
[0023] 1)將步驟S1所得的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液依次按梯度稀釋獲得不同濃度的菌懸液；
[0024] 2)利用所獲得的不同濃度的菌懸液分別按照步驟S1所述在玻碳電極表面制備聚 苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜，蒸饋水漂洗后于0.1M此S〇4溶液中測定其循環(huán)伏安曲線，掃描速率為 50mV/s，掃描的電壓范圍為-0.2~0.9V;
[0025] 3)W細(xì)菌濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，W2)中所得循環(huán)伏安曲線最高峰所對應(yīng)的峰電流為 縱坐標(biāo)，繪制所述聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜修飾電極標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026] 上術(shù)方案中，所述步驟S3具體包括W下步驟：
[0027] 1)利用待測菌懸液按照步驟S1所述在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜， 按照步驟S2所述測定其循環(huán)伏安曲線；
[0028] 2)確定循環(huán)伏安曲線的峰電流，根據(jù)步驟S2中所得聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜修飾電 極標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其細(xì)菌濃度。
[0029] 現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果：
[0030] 1、本發(fā)明利用電聚合法在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜，由于固定于 玻碳電極表面的細(xì)菌對苯胺在電極表面聚合具有阻礙作用，從而使得所制備聚苯胺/細(xì)菌 復(fù)合薄膜表現(xiàn)出不同的電化學(xué)特性，能實現(xiàn)細(xì)菌菌體濃度的快速準(zhǔn)確檢測。
[0031] 2、本發(fā)明實施過程中無需像傳統(tǒng)平板計數(shù)法等對細(xì)菌進行培養(yǎng)后再統(tǒng)計，因此耗 時短、操作簡便。
[0032] 3、本發(fā)明W苯胺為主要試劑，待測液消耗量少，因此檢測費用低、設(shè)備簡單。
[0033] 4、本發(fā)明所述方法對同一細(xì)菌菌體濃度測量具有重復(fù)性好、檢測線性范圍寬的優(yōu) 點。
【附圖說明】
[0034] 圖1為聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜的整體制備過程示意圖。
[0035] 圖2(a)為利用循環(huán)伏安法制備聚苯胺-細(xì)菌復(fù)合薄膜過程中電極循環(huán)伏安曲線變 化情況圖。
[0036] 圖2(b)為所制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜與純聚苯胺膜的形貌對比圖。
[0037] 圖3(a)為采用不同濃度枯草芽抱桿菌菌懸液所制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合膜修飾玻碳 電極在0.1M出S化溶液中的循環(huán)伏安曲線圖。
[0038] 圖3(b)為聚苯胺/枯草芽抱桿菌薄膜修飾電極的循環(huán)伏安曲線在0.2V處峰電流的 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0039] 圖4為不同濃度枯草芽抱桿菌菌懸液樣本采用平板菌落計數(shù)法和本發(fā)明所述聚苯 胺/細(xì)菌薄膜計數(shù)法檢測結(jié)果對比圖。
[0040] 圖5為聚苯胺/大腸桿菌薄膜修飾電極的循環(huán)伏安曲線在0.2V處峰電流的標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖。
[0041] 圖6為聚苯胺/嗜熱鏈球菌薄膜修飾電極的循環(huán)伏安曲線在0.2V處峰電流的標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖。
【具體實施方式】
[0042] 下面分別W枯草芽抱桿菌、埃希氏大腸桿菌和嗜熱鏈球菌為【具體實施方式】并結(jié)合 附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0043] 實施例1
[0044] 本發(fā)明使用的苯胺、硫酸、酵母提取物、膜化蛋白腺均購自國藥集團化學(xué)試劑有限 公司，苯胺經(jīng)過減壓蒸饋后使用。電化學(xué)測定采用CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有 限公司）。本實施例W枯草芽抱桿菌為例進行說明，菌種購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中 屯、。
[0045] 所述細(xì)菌計數(shù)方法包括W下步驟：
[0046]S1、利用電聚合法在玻碳電極表面制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜；
[0047] 圖1顯示了聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜的整體制備過程，具體步驟如下：
[004引（1)標(biāo)準(zhǔn)菌懸液準(zhǔn)備
[0049] 取酵母提取物5g，膜化蛋白腺lOg，氯化鋼lOg，加水配制成1L培養(yǎng)液，利用化0H調(diào) 節(jié)抑至7.0，121°C，20min，高壓滅菌后接種適量枯草芽抱桿菌菌種，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 20h。將所獲得菌液在3500g離屯、力下4°C離屯、lOmin清洗3次，得到標(biāo)準(zhǔn)枯草芽抱桿菌懸浮 液，采用平板菌落計數(shù)法測定其菌體濃度為5.33X108CFU·ml/i;
[0050] (2)細(xì)菌在玻碳電極表面的固定
[0化1 ] 玻碳電極依次用金相砂紙、0.3μηι和0.05μηι的AI2O3粉末拋光，再分別用乙醇、水超 聲清洗后，在ImM的K3[Fe(CN)6]溶液中測定玻碳電極的循環(huán)伏安(CV)曲線，直至氧化-還原 峰電位差降至80mVW內(nèi)，驚干，確保電極初始狀態(tài)一致;取10化標(biāo)準(zhǔn)枯草芽抱桿菌懸液滴至 玻碳電極表面，經(jīng)50°C烘箱15min烘干即可將細(xì)菌固定在所述玻碳電極表面，得到細(xì)菌/玻 碳電極；
[0052] (3)苯胺在電極表面的聚合
[0053] 將上述固定有細(xì)菌的玻碳電極置于含有0.1M苯胺的硫酸(0.5M)溶液中采用循環(huán) 伏安法W銷絲電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極掃描。為了獲取較高的檢測靈敏 度，優(yōu)選地，掃描10圈，掃描速率為50mV/s，電壓下限為-0.2V，電壓上限為0.9V，得到聚苯 胺/枯草芽抱桿菌復(fù)合薄膜。圖2(a)為利用循環(huán)伏安法制備聚苯胺/細(xì)菌復(fù)合薄膜過程中電 極循環(huán)伏安曲線變化情況，其中出現(xiàn)了3對典型的氧化還原峰：1曰/1(3，113八1(3，皿3/皿(3，說 明了苯胺在電極表面的成功聚合;此外，掃描電流隨著掃描圈數(shù)的增加逐漸增大，運印證了 聚苯胺聚合時的自催化作用。圖2(b)是