一種檢測(cè)肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物排泄物中有機(jī)砷的形態(tài)分析檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 洛克沙胂（3-硝基-4-羥基苯砷酸，Roxarsone)是一種有機(jī)砷（As)化合物，因其 具有抗菌和促生長(zhǎng)效果，可作為添加劑在肉雞飼料中使用。洛克沙胂在動(dòng)物體內(nèi)很少被降 解，多是以原藥的形式隨糞便排出，進(jìn)入環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的局部砷污染。在生態(tài)環(huán)境日趨惡化 的今天，人們對(duì)有機(jī)砷制劑在環(huán)境中的降解、迀移以及對(duì)環(huán)境生物造成的影響越來(lái)越關(guān)注， 洛克沙胂主要通過(guò)畜禽糞便進(jìn)入環(huán)境，進(jìn)入環(huán)境后，可能通過(guò)生物的或非生物的降解反應(yīng) 轉(zhuǎn)變?yōu)檗|移能力更強(qiáng)、毒性更大的含砷化合物，但迄今人們對(duì)這一過(guò)程還不甚了解。為了研 究洛克沙胂隨畜禽糞便排出后的迀移轉(zhuǎn)化規(guī)律，評(píng)估洛克沙胂在環(huán)境中的殘留狀況與生態(tài) 毒理學(xué)，急需建立一種快速準(zhǔn)確的方法對(duì)洛克沙胂及其降解產(chǎn)物予以分析。
[0003] 有機(jī)砷及其降解產(chǎn)物均屬極性化合物，其在復(fù)雜環(huán)境樣品中的分析方法首選是 高壓液相色譜（HPLC)法，將HPLC的分離優(yōu)勢(shì)與串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS)的鑒別特異性結(jié)合，必 能進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度與靈敏度。迄今已有部分利用HPLC-MS/MS檢測(cè)有機(jī)砷化物 的文獻(xiàn)報(bào)道，但研究目標(biāo)多為檢測(cè)土壤和食品基質(zhì)中的有機(jī)砷殘留及其降解產(chǎn)物，而利用 HPLC-MS/MS檢測(cè)畜禽排泄物中洛克沙胂轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究相對(duì)較少。因糞便成分復(fù)雜，樣品 基質(zhì)極大地影響待測(cè)化合物在質(zhì)譜中的離子化，所以必須對(duì)樣品進(jìn)行必要的提取凈化前處 理，以減少基質(zhì)干擾。
[0004] 然而，前人的研究多著眼于總砷含量及無(wú)機(jī)砷形態(tài)的分析，如現(xiàn)有的關(guān)于砷測(cè)定 的標(biāo)準(zhǔn)包括：土壤總砷測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1121. 11-2006 ;水質(zhì)砷測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SL 327. 1-2005 ;食品添加劑中總砷測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009. 76-2003 ;稻米中總砷測(cè)定的 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1099-2006 ;飼料中總砷測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13079-2006 ;以及食品中總 砷及無(wú)機(jī)砷測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009. 11-2003,此外，與砷測(cè)定有關(guān)的專(zhuān)利包括：水產(chǎn)品 中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法（授權(quán)公告號(hào)：CN101261258B)等，上述方法均不涉及有機(jī)砷形態(tài)的 分析測(cè)定。由于檢測(cè)方法的不完善，導(dǎo)致洛克沙胂通過(guò)糞便進(jìn)入環(huán)境后的降解途徑尚不清 楚。因此，尋求一種有效檢測(cè)牲畜糞便中洛克沙胂及其有機(jī)降解產(chǎn)物也是目前研究環(huán)境中 有機(jī)砷及其降解產(chǎn)物的首要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)上述技術(shù)缺陷提供一種檢測(cè)肉雞糞便中洛克沙胂及其 降解產(chǎn)物的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產(chǎn)物 的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)使用甲醇/水作為提取液對(duì)糞便樣品進(jìn)行提取；
[0008] 2)采用固相萃取柱進(jìn)一步濃縮凈化樣品；
[0009] 3)使用高效液相色譜一離子阱一飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。
[0010] 進(jìn)一步地，上述步驟可優(yōu)化為：
[0011] 1)將糞便樣品進(jìn)行冷凍干燥，在冷凍干燥的樣品中加入體積比為1:9的甲醇/水 溶液進(jìn)行超聲提取，將提取液進(jìn)行尚心；
[0012] 2)將固相萃取柱進(jìn)行固定，活化萃取柱，加入步驟1)中獲得的上清液，再用淋洗 液進(jìn)行沖洗小柱，淋洗后再用洗脫液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行過(guò)濾；
[0013] 3)使用高效液相色譜一離子阱一飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，步驟1)中糞便樣品與甲醇/水溶液的質(zhì)量體積比是 1:20 ~60g/ml;
[0015] 超聲提取的條件是：室溫下超聲提取30~50min;
[0016] 離心的速率是：10000-15000轉(zhuǎn)/分鐘。
[0017] 更近一步地，步驟1)可優(yōu)化為：將糞便樣品進(jìn)行冷凍干燥，按照樣品與甲醇/水溶 液的質(zhì)量體積比1:20~60g/ml在冷凍干燥的樣品中加入體積比為1:9的甲醇/水溶液， 在室溫下進(jìn)行超聲提取30~50min，提取液以10000-15000轉(zhuǎn)/分鐘速率離心。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，上述步驟2)中用lmL甲醇和lmL超純水活化萃取柱；
[0019] 加入上清液的量為1ml;
[0020] 沖洗小柱的淋洗液的量為1ml;
[0021] 洗脫小柱的洗脫液的量為1ml;
[0022] 洗脫的速度為1.OmL/min;
[0023] 過(guò)濾的條件為：0. 45微米微孔濾膜過(guò)濾。
[0024] 其中，上述的淋洗液為體積比為95:5的0· 05mol/L乙酸鈉/甲醇，pH為7 ;洗脫液 為體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水，pH為2。
[0025] 更近一步地，步驟2)可優(yōu)化為：將固相萃取小柱固定，用lmL甲醇和lmL超純水活 化萃取柱，然后加入lmL離心所得的提取上清液，再用lmL體積比為95:5的0. 05mol/L乙 酸鈉/甲醇淋洗液沖洗小柱，淋洗后用lmL體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/ 水洗脫液以1.OmL/min的流速洗脫，洗脫液再經(jīng)0. 45微米微孔濾膜過(guò)濾。
[0026] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明首先是根據(jù)洛克沙胂的理化性質(zhì)，選取水相比例較高 的提取液對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的微量待測(cè)物進(jìn)行有效提取，并根據(jù)其等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)洗脫液的pH值 保證洛克沙胂被充分洗脫，提高回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明采用體積比為1:9的甲醇/水提取 雞糞樣品中的洛克沙胂殘留，可以獲得較高的提取率。此外，本發(fā)明再采用固相萃取柱進(jìn)一 步凈化樣品時(shí)，使用的是經(jīng)多次優(yōu)化獲得的pH為2,體積比為5:65~75:20~30的甲酸 /甲醇/水的洗脫液，該優(yōu)化的洗脫液既能保證獲得理想的回收率，又能去除樣品中的一些 極性化合物雜質(zhì)，以降低質(zhì)譜檢測(cè)中的背景干擾。利用高壓液相色譜法分析該方法的加標(biāo) 回收率，結(jié)果表明，外標(biāo)均有較高的回收率，可見(jiàn)本發(fā)明提供的分離方法的回收率能滿足后 續(xù)檢測(cè)的要求，因而是非常理想的分離肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產(chǎn)物的方法。
[0027] 本發(fā)明提供的利用高效液相色譜一離子阱一飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS-IT-T0F) 檢測(cè)肉雞糞便中的洛克沙胂及其降解產(chǎn)物的方法，經(jīng)離子阱一飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析后表 明，洛克沙胂（質(zhì)譜中的相對(duì)質(zhì)荷比為m/z261. 94)在肉雞糞便中的降解產(chǎn)物有以下三種， 分別為：4-羥基-3-硝基苯基二氧化砷（m/z243. 92) ;4-羥基-3-硝基苯酚（m/z153. 01) 和3,4-二羥基苯酚（m/z122. 91)?？梢?jiàn)，利用離子阱一飛行時(shí)間多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析洛克沙 胂及其降解產(chǎn)物的方法具有簡(jiǎn)單易行，高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為實(shí)際樣品的液相色譜圖，其中洗脫時(shí)間為7. 2min的特征峰為洛克沙胂；以 及
[0029]圖2為洛克沙胂以及三種代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，其中（2a)中①為質(zhì)荷比 為261. 93的洛克沙胂（3-硝基-4-羥基苯砷酸）；（2b)中②為質(zhì)荷比為243. 92的4-羥 基-3-硝基苯基二氧化砷；（2c)中③為質(zhì)荷比為153. 01的4-羥基-3-硝基苯酚；（2d)中 ④為質(zhì)荷比為123. 01的3,4-二羥基苯酚。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 目前現(xiàn)有的畜禽糞便樣品處理方法中，洛克沙胂加標(biāo)回收率太低，不能滿足檢測(cè) 要求，其原因可能是洛克沙胂與糞便樣品中的金屬離子等雜質(zhì)相結(jié)合形成難提取物質(zhì)，本 發(fā)明為了克服上述技術(shù)缺陷，首先根據(jù)洛克沙胂的理化性質(zhì)，選取水相比例較高的提取液 對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的微量待測(cè)物進(jìn)行有效提取，并根據(jù)其等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)洗脫液的pH值保證洛克 沙胂被充分洗脫，提高回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明采用體積比為1:9的甲醇/水溶液提取雞糞 樣品中的洛克沙胂殘留，可以獲得較高的提取率，而且采用固相萃取柱進(jìn)一步凈化樣品時(shí)， 優(yōu)化的pH為2,體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水的洗脫液既能保證獲得理 想的回收率，又能去除樣品中的一些極性化合物雜質(zhì)，以降低質(zhì)譜檢測(cè)中的背景干擾，因而 是較為理想的前處理方法。
[0031] 本發(fā)明又采用離子阱一飛行時(shí)間聯(lián)用質(zhì)譜儀對(duì)預(yù)處理過(guò)得樣品進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明 所用的離子阱一飛行時(shí)間聯(lián)用質(zhì)譜儀是將高效液相色譜和離子阱質(zhì)譜儀（IONSTRAP)以及 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOFMS)串聯(lián)起來(lái)，其在準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)分辨率和靈敏度方面較其它質(zhì)譜法有 較大提高，能夠準(zhǔn)確提供分子的質(zhì)量信息，增加了分子式確定的可信度，是鑒定有機(jī)化合物 的有力手段。故本發(fā)明利用LCMS-IT-T0F質(zhì)譜儀鑒定有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)肉 雞糞便中洛克沙胂及其有機(jī)降解產(chǎn)物。
[0032] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明 的范疇：
[0033] 實(shí)施例1肉雞糞樣中洛克沙胂回收試驗(yàn)
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