一種金不換藥材中多種生物堿含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 中藥質(zhì)量分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種金不換藥材多成分含量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣西特色藥材金不換是千金藤屬防己科植物金不換塊根，又名地不容、山烏龜，主 要分布于廣西、云南、四川等地，生長于海拔480米的地區(qū)，見于石灰?guī)r地區(qū)的石山上，是廣 西壯族等少數(shù)民族民間常用草藥]?！稄V西中藥材標準》第二冊收載的金不換有三個品種， 分別為廣西地不容 H.S.Lo、小花地不容 H.S.LoetM.Yang、桂南地不容 Arawgsieftsi··?H.S.LoetM.Yang。金不換塊根 入藥，味苦而辛，性涼，有小毒，其功能為清熱解毒、散瘀消腫、健胃止痛，用于胃、十二指腸 潰瘍疼痛、上呼吸道感染、急性胃腸炎、菌痢、牙痛、神經(jīng)痛、癰瘡腫毒、跌打腫痛等病癥。塊 根富含多種具有生物活性的生物堿，例如：延胡索乙素、千金藤堿、克班寧、青藤堿、青風藤 堿、巴馬汀、千金藤寧堿、羅默堿、去氫羅默堿等。
[0003] 近年金不換市場需求量持續(xù)增加，野生資源逐年減少，人工栽培發(fā)展緩慢，使得 金不換資源蘊藏量和產(chǎn)量都在大幅下降，導致市場上出現(xiàn)了很多偽劣品，給金不換質(zhì)量和 用藥安全性及有效性帶來了很大的沖擊，已成為制約金不換藥材系列開發(fā)的瓶頸。
[0004] 目前針對該藥材的傳統(tǒng)的形態(tài)特征和理化特性的鑒別方法具有一定的局限性， 不足以從整體上控制金不換質(zhì)量，金不換作為一味臨床常用中藥，，有必要建立一種科學 的其多成分含量檢測方法對金不換質(zhì)量進行評價。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種利用高效液相色譜法測定廣西特色藥材金不換的多種 生物物堿含量的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于金不換成分復雜，富含多種有生物 活性的生物堿成分，現(xiàn)有技術(shù)或方法無法滿足對金不換進行多成分質(zhì)量檢測的問題，進而 提供一種準確度高、簡便、快速的檢測金不換質(zhì)量的方法。為全面和綜合評價該藥材提供重 要的判斷依據(jù)，保證質(zhì)量穩(wěn)定和臨床療效安全可靠。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 一種金不換藥材中多種生物堿含量測定方法，其特征在于對延胡索乙素、巴馬汀和青 藤堿同時進行測定。
[0007] 具體包括如下步驟： a) 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液為流動相， 梯度洗脫：流動相梯度程序見表1，流速：1.OmL/min，柱溫：室溫，檢測波長：282nm，理 論塔板數(shù)按延胡索乙素計不低于4000 ; b) 對照品混合溶液制備 精密稱取延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿等適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制 成延胡索乙素濃度為lmg/mL和巴馬汀濃度為lmg/mL和青藤堿濃度為0.lmg/mL的溶液； c) 供試品溶液制備 取金不換藥材粉末(過60目篩）精密稱定2g，置于100ml錐形瓶中，精密加入50-60% 乙醇溶液100mL，稱定重量，超聲15min，回流提取60min，放冷，用50-60%乙醇補足減失的 重量，用0. 45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； d) 測定 分別精密吸取對照品混合溶液和供試品溶液各10-20μL，注入液相色譜儀，測定，即 得。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點或積極效果： 本發(fā)明可用于金不換藥材的多種生物堿有效成分含量檢測和控制，為全面和綜合評價 該藥材提供重要的判斷依據(jù)。本發(fā)明解決了金不換成分復雜而傳統(tǒng)法局限性以及其質(zhì)量難 以把控的技術(shù)問題，提供了一種準確度高，操作簡便快速，成本低廉的多成分檢測方法， 具有良好的應用前景和經(jīng)濟效益。
【附圖說明】： 圖1金不換藥材高效液相色譜圖（Α.對照品混合溶液色譜圖Β.供試品溶液色譜圖）
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合最佳實施舉例對本發(fā)明進一步說明，但本發(fā)明保護范圍并不僅限于以下實 施舉例。
[0010] 實施舉例1 : 1.材料 1. 1主要儀器 高效液相色譜儀：島津LC-20A，配置紫外檢測器，色譜工作站，日本島津公司；超純 水制造系統(tǒng)：成都越純科技有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超聲儀器 有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：101-1-S，上海躍進醫(yī)療器械廠；低溫冷卻液循環(huán)栗： DLSB-5/20,鄭州長城科工貿(mào)有限公司；循環(huán)水式真空栗：SHZ-D(III)，鞏義市英峪予華儀 器廠；電熱恒溫水浴鍋：GSY-n不銹鋼，北京市醫(yī)療設備廠；真空干燥箱：D2F-250,鄭州長 城科工貿(mào)有限公司；電子分析天平：ME215S，北京賽多麗斯儀器系統(tǒng)有限公司；多功能粉 碎機：ST-02A100g，永康市帥通工具有限公司。
[0011] 1.2試劑與藥品 金不換：購于廣西境內(nèi)及周邊多個藥材市場，為廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院劉宗河教 授所鑒定為防己科千金藤屬植物廣西地不容StephaniakwangsiensisH.S.Lo、小花地不 容StephaniamicranthaΗ·S.LoetM.Yang、桂南地不容StephaniakwangsiensisH.S.Lo etM.Yang的干燥塊根，10份金不換藥材來源情況見表1。
[0012] 對照品：延胡索乙素，批號110726-201414,含測用，中國食品藥品檢定研究院； 巴馬汀，批號13022707,含測用，成都貝斯特試劑有限公司；青藤堿，批號110774-200507， 含測用，中國食品藥品檢定研究院；千金藤堿，批號2111647-200301，含測用，中國食品藥 品檢定研究院；異紫堇定堿，批號Y-195-140211，含測用，成都瑞芬思生物科技有限公司。
[0013] 磷酸、乙醇：分析純；甲醇、乙腈：色譜純；等。
[0014] 2 方法 2. 1色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 采用Hypersil0DS2 5μηι(4. 6mmX250mm)色譜柱，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液為流動 相，梯度洗脫：流動相梯度程序見表1，流速：1.OmL/min，柱溫：室溫，檢測波長：282nm， 進樣量：10μL，所有色譜峰達到基線分離，供試品溶液中延胡索乙素峰保留時間與相應對 照品峰保留時間一致，且在60分鐘內(nèi)完成。理論塔板數(shù)按延胡索乙素計不低于4000,均與 相鄰雜峰分離度>1.5。色譜圖參見圖1。
[0015] 2.2對照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素對照品250mg，巴馬汀對照品250mg，青藤堿對照品25mg，置于 5〇mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得備液。精密量取備液2mL，置于10mL容量 瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液，其中延胡索乙素濃度為lmg/mL 和鹽酸巴馬汀濃度為lmg/mL和青藤堿濃度為0.lmg/mL。
[0016] 2. 3供試品溶液制備 取金不換藥材粉末(過60目篩)精密稱定2g，置于100ml錐形瓶中，精密加入50%乙醇 溶液100mL，稱定重量，超聲15min后，回流提取60min，放冷，用50%乙醇補足減失的重量， 用0. 45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0017] 2.4線性和范圍考察 分別精密吸取對照品混合溶液備液0. 5mL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL置于10mL容量瓶，加 甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得標準系列混合溶液①~⑥，進樣量：20yL，注入色譜儀， 按上述色譜條件測定相應峰面積，以濃度為橫坐標（X)、峰面積為縱坐標（Y)，分別繪制三 種成分的標準曲線。 設線性方程為Y=bX+a，將上述各組實驗數(shù)據(jù)代入該方程中計算，進行線性回歸，得到三 種成分回歸方程分別為： Y 延胡索乙素=1.80X105X- 1.70X105，r= 0.9999 Y 巴馬汀=1· 30Χ105Χ- 3· 90X104，r= 0. 9998 Y 青藤堿=1· 90X105X+ 1· 96X104，r= 0. 9999 結(jié)果表明：延胡索乙素在濃度〇· 25mg/mL~2. 5mg/mL范圍內(nèi)，巴馬汀在濃度0· 25mg/mL~2. 5mg/mL范圍內(nèi)，青藤堿在濃度0. 025mg/mL~0. 25mg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈較好的 線性關(guān)系。
[0018] 2.5精密度試驗 同一濃度對照品混合溶液，按上述色譜條件，進樣20μL，1d內(nèi)連續(xù)進樣6次，測定 峰面積，計算，延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿峰面積日內(nèi)精密度RSD分別為0. 14%、0. 18%、 0.16%;同一濃度對照品混合溶液，按上述色譜條件，進樣20yL，連續(xù)3d每天進樣2 次，測定峰面積，計算，延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿峰面積日間精密度RSD分別為0. 49%、 0. 35%、0. 68%，表明精密度良好。
[0019] 2.6穩(wěn)定性試驗 同一供試品溶液，間隔不同時間測定，在〇h、2h、4h、8h、10h、12h、24h各進樣20yL，按 上述色譜條件測定峰面積，計算RSD。結(jié)果：延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿峰面積RSD分別 為0. 53%、0. 71%、0. 68%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
[0020] 2. 7重復性試驗 取同一批樣品6份，制備供試品溶液，進樣量20μL，按上述色譜條件測定峰面積，計算 含量和RSD，結(jié)果：延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿含量RSD分別為0. 82%、0. 59%、0. 62%，表明 方法重復性較好。
[0021] 2.8加樣回收試驗 精密稱取同批金不換（已知其中延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿的百分含量）lg，置具 塞錐形瓶中，精密添加適量對照品混合溶液備液（延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿濃度分別 為5mg/mL、5mg/mL、0. 5mg/mL)，平行試驗6份，進樣量20μL，按樣品含量測定項測定峰面 積，計算含量和回收率。結(jié)果：延胡索乙素平均回收率為97. 97%，RSD為0. 98%，巴馬汀平均 回收率98. 53%，RSD為1. 07%,青藤堿平均回收率96. 75%，RSD為1. 13%。
[0022] 2.9樣品測定 利用上述色譜條件測定金不換藥材中延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿含量，參見圖1和 表1。圖1中，Α為對照品混合溶液色譜圖，Β為供試品溶液色譜圖；其中，峰1、2、3分別為 延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿。
[0023] 由表1中數(shù)據(jù)，進行比較，可看出品種來源、產(chǎn)地、采收加工等因素對金不換藥材 質(zhì)量影響較大。
[0024] 以上試驗顯示，該測定方法穩(wěn)定可靠。通過對基地實施GAP管理，嚴控化肥、農(nóng)藥、 采收加工等環(huán)節(jié)，使金不換藥材質(zhì)量可靠。
【主權(quán)項】
1. 一種金不換藥材中多種生物堿含量測定方法，其特征在于對延胡索乙素、巴馬汀和 青藤堿同時進行測定，具體方法如下： a) 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液為流動相， 梯度洗脫：流動相梯度程序見表1，流速：1.0mL/min，柱溫：室溫，檢測波長：282nm，理 論塔板數(shù)按延胡索乙素計不低于4000 ; b) 對照品混合溶液制備 精密稱取延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿等適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制 成延胡索乙素濃度為lmg/mL和巴馬汀濃度為lmg/mL和青藤堿濃度為0.lmg/mL的溶液； c) 供試品溶液制備 取過60目篩的金不換藥材粉末，精密稱定2g，置于100ml錐形瓶中，精密加入50-60% 乙醇溶液100mL，稱定重量，超聲15min，回流提取60min，放冷，用50-60%乙醇補足減失的 重量，用0. 45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； d) 測定 分別精密吸取對照品混合溶液和供試品溶液各10-20μL，注入液相色譜儀，測定，即 得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金不換藥材中多種生物堿含量測定方法，包括對延胡索乙素、巴馬汀和青藤堿同時進行測定，該方法準確度高、簡便、快速，可為全面綜合評價藥材提供重要的判斷依據(jù)。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105372342
【申請?zhí)枴緾N201510568928
【發(fā)明人】王捷, 蔣偉哲, 葉勇, 蘇志恒, 蔣敏捷, 巫玲玲
【申請人】廣西醫(yī)科大學制藥廠
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年9月9日