儀、電化學(xué) 和熒光測定法。此外，也已經(jīng)使用配體結(jié)合方法諸如競爭性和非競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定 法（ELISA)和放射性免疫測定（RIA)或者其它標(biāo)記方案。在小分子分析中基于酶的測定法 有長期的應(yīng)用歷史。使用基于細(xì)胞或組織的生物測定方法也可用作檢測手段。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施例中，毛發(fā)拔除引起的小分子定量可利用與用于膠帶剝除樣品的方法相同的堿性 提取和分析方法進(jìn)行。
[0052] 膠帶剝除提取物的蛋白質(zhì)測宙：
[0053] 用上述適用方法測得的皮膚膠帶剝除物樣品上的小分子代謝物含量可用膠帶剝 除提取物中存在的蛋白質(zhì)的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過用小分子含量除以膠帶剝除提取物中的蛋 白質(zhì)的量完成標(biāo)準(zhǔn)化。
[0054] 膠帶剝除提取物中的蛋白質(zhì)的量或用于測定皮膚小分子含量的等同基質(zhì)可使用 文獻(xiàn)中描述的多種蛋白質(zhì)測定方法進(jìn)行測定。此類方法的實(shí)例包括總氮測定、總氨基酸 測定和基于任何比色、熒光、和化學(xué)發(fā)光方法的蛋白質(zhì)測定。這些方法可涉及或可不涉及 在蛋白質(zhì)測定前進(jìn)一步制備膠帶剝除提取物的樣品。下文給出了膠帶剝除提取物中用于 蛋白質(zhì)測定的特定方法的非限制性實(shí)例。對蛋白質(zhì)測定方法、它們的適用性和限制的綜 述在 Thermo Scientific Pierce Protein Assay Technical Handbook 中進(jìn)行了 描述， 其可從下文的鏈接中下載，以引用方式并入本文。www. piercenet. com/Files/1601669_ PAssayFINAL_Intl. pdf。關(guān)于蛋白質(zhì)測定的其它信息可見于Redinbaugh，M. G.和Turley， R. B. (1986), Adaptation of the bicinchoninic acid protein assay for use with microtiter plates and sucrose gradient fractions. Anal. Biochem. 153, 267-271，以弓| 用方式并入本文。
[0055] 將用BCA?Protein Assay Kit提取并分析取樣自人皮膚的粘合帶的蛋白質(zhì)含量。 將用常規(guī)的提取緩沖液提取取樣自人皮膚的膠帶剝除物。在提取后，將膠帶提取物的等分 試樣轉(zhuǎn)移到96-孔聚丙烯深孔板中并儲存在2-8°C用于蛋白質(zhì)測定。
[0056] BCA?Protein Assay Kit的作用機(jī)制為在堿性介質(zhì)中由蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu 1+并由二喹啉甲酸（BCA)敏感選擇性比色檢測Cu+1。通過一個(gè)Cu1+離子螯合兩個(gè)BCA分子形 成的紫色反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)出在562nm波長處的強(qiáng)吸光度。使用酶標(biāo)儀測量光密度（0D)。提高 的牛血清白蛋白（BSA)的濃度（以微克每毫升（μ g/mL)表示）在該測定法中用于生成校 準(zhǔn)曲線。從BSA原液中制備的合適測定QC將用于監(jiān)控樣品分析期間的測定法性能。
[0057] 在本發(fā)明的一個(gè)另選的實(shí)施例中，可通過直接測量粘合劑或粘合劑制品上的蛋白 質(zhì)來完成蛋白質(zhì)測定，諸如用 SquanieScarT' 850A(CuDerm Corporation, Dallas, Texas) 測量蛋白質(zhì)。
[0058] SM
[0059] 代謝物表汰譜小分子作用的基本討稈
[0060] 受試者由有資質(zhì)的分級人員進(jìn)行評估以確定他們的頭皮狀態(tài)。頭皮肩受試者由有 資質(zhì)的分級人員進(jìn)行評估以確定他們的可見片狀剝落水平。對無頭皮肩的健康頭皮受試者 進(jìn)行基線評估以確定各生物標(biāo)記的歸一化水平。在這個(gè)研究中，有60個(gè)無頭皮肩受試者， 對它們進(jìn)行基線評估。119個(gè)頭皮肩患者用包含1%的ZPT的去頭皮肩洗發(fā)劑治療，115個(gè) 頭皮肩患者用包含1 %的硫化硒的去頭皮肩洗發(fā)劑治療。對他們進(jìn)行基線評估，并且在使用 產(chǎn)品三周后再次評估。受試者在用去頭皮肩洗發(fā)劑治療前，用常規(guī)的無調(diào)理劑的非去頭皮 肩洗發(fā)劑洗兩周。頭皮肩受試者用去頭皮肩洗發(fā)劑（包含1%吡啶硫酮鋅或1%硫化硒的 洗發(fā)劑組合物）治療三周；從由有資質(zhì)的分級人員在基線隨訪上測定的最高片狀剝落八分 體中收集膠帶剝除樣品。對于頭皮肩受試者，在基線和三周產(chǎn)品治療后獲取頭皮膠帶剝除 物。對于無頭皮肩受試者，僅在基線獲取頭皮膠帶剝除物。將膠帶保存在-80°C直到進(jìn)行提 取。通過分開毛發(fā)，根據(jù)需要施用D-Squam,膠帶（CuDerm Corporation)并摩擦該膠帶 來對含頭皮肩部位取樣。對于無頭皮肩受試者，對無片狀剝落部位取樣。將膠帶置于預(yù)先 標(biāo)記的無菌12孔板中進(jìn)行貯藏。
[0061] 用常規(guī)的提取緩沖液通過在冰上超聲處理來提取樣品。D-Squarn，膠帶樣品提 取物的等分試樣隨后被轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的聚丙烯收集管中并凍存在_80°C下以進(jìn)行代謝物 表達(dá)譜分析。另一份等分試樣指定用BCA?Protein Assay Kit進(jìn)行可溶解蛋白質(zhì)分析。對 于這一分析，取出由甲醇和水組成的等分試樣在柔和氮?dú)饬飨赂稍?。將樣品重懸在合適的 含水緩沖液（例如PBS/SDS(1X PBS+0. 2% SDS)中并分析可溶解蛋白質(zhì)。
[0062] 在提取后，通過Metabolon，Inc的LC/MS/MS (陽離子和陰離子模式）或GC/MS/MS 平臺分析樣品的代謝物表達(dá)譜?；衔锏挠嘘P(guān)定量值隨后根據(jù)樣品體積進(jìn)行調(diào)節(jié)，并如上 文列出的BCA蛋白質(zhì)測定法所測定對提取物中的可溶解蛋白質(zhì)的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對來自去 頭皮肩洗發(fā)劑治療組的樣品進(jìn)行基線和三周分析，并且對無頭皮肩組的樣品僅進(jìn)行基線分 析。對代謝物進(jìn)行檢測，并基于在Metabolon化學(xué)參考庫中匹配的已知化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。 匹配已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝物在它們相應(yīng)的一般生物化學(xué)途徑中標(biāo)出。配對T檢驗(yàn)用于分析 無頭皮肩（健康的）、頭皮肩基線和經(jīng)頭皮肩治療的受試者的差異。對經(jīng)頭皮肩治療的受試 者與無頭皮肩受試者進(jìn)行比較以確定在用去頭皮肩產(chǎn)品治療時(shí)的歸一化程度。
[0063] MM.
[0064] 在代謝物表達(dá)譜方法和條件下檢測膠帶剝除物中的總計(jì)255種生物化學(xué)物質(zhì)。這 些生物化學(xué)物質(zhì)將提供豐富的信息源，從而進(jìn)一步了解皮膚健康狀態(tài)。比較無頭皮肩受試 者與頭皮肩受試者的統(tǒng)計(jì)分析顯示出多種生物化學(xué)物質(zhì)可用于區(qū)分健康皮膚與皮膚病癥。 這些生物化學(xué)物質(zhì)將可用作生物標(biāo)記用于診斷頭皮肩病癥。在基線頭皮肩受試者和用去頭 皮肩洗發(fā)劑治療后的頭皮肩受試者之間多種生物化學(xué)物質(zhì)發(fā)生顯著變化。這些生物化學(xué)物 質(zhì)將為有用的生物標(biāo)記，用于測定頭皮肩病癥的治療改善程度和完全性。
[0065] 表1包含列出的分子，它們在頭皮肩和非頭皮肩樣品之間、以及在用包含吡啶硫 酮鋅（ZPT)或硫化硒的多種去頭皮肩治療劑治療三周之前和之后具有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差 異。兩種治療劑為有效的去頭皮肩制劑，具有不同的去頭皮肩活性物質(zhì)。這組標(biāo)記物表現(xiàn) 出在頭皮肩和正常頭皮狀況之間的差異，并且用于評估去頭皮肩治療的功效。
[0066] 表2至表7列出各生物化學(xué)物質(zhì)基于它們的代謝途徑的平均值，以及在頭皮肩和 非頭皮肩之間、去頭皮肩治療之前和之后、以及非頭皮肩治療對頭皮肩治療的比較結(jié)果的P 值。
[0067] 頭皮過敏是頭皮肩患者的常見癥狀。它很大程度上是由炎癥和對微生物的宿主免 疫響應(yīng)引起的。已知炎癥能夠誘發(fā)細(xì)胞死亡，這導(dǎo)致包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、和碳水化合物 的所有類型生物分子的顯著結(jié)構(gòu)破壞。列出的小分子包括氨基酸、氨基酸代謝中間體（表 2)、二肽（表3)、嘌呤和嘧啶代謝中間體（表4)，它們被鑒定為皮膚病癥生物標(biāo)記。這些分 子的含量在頭皮肩受試者中相對于無頭皮肩受試者升高，并且在用去頭皮肩洗發(fā)劑治療后 降低，指示頭皮肩病癥的改善。這符合相同臨床受試者的自我評估數(shù)據(jù)，他們在用去頭皮肩 洗發(fā)劑治療后報(bào)告出較輕的頭皮過敏。這些代謝物可用作皮膚過敏的客觀量度。
[0068] 據(jù)信一些生物化學(xué)物質(zhì)可通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)來增加炎癥。例如，嘌呤代謝可 用作炎性響應(yīng)增加的指示（即，表4)。具體地，次黃嘌呤轉(zhuǎn)化成黃嘌呤以及隨后黃嘌呤轉(zhuǎn) 化成尿酸需要氧來活化黃嘌呤氧化酶，這是生成H202的主要來源。在人皮膚的情況下（例 如頭皮肩），增加的氧化應(yīng)激反應(yīng)將導(dǎo)致更高水平的嘌呤降解，反映出次黃嘌呤和黃嘌呤含 量提高。在從頭皮肩患者的頭皮獲取的膠帶剝除物中顯著提高的腺苷、鳥嘌呤、鳥苷、肌苷、 次黃嘌呤、和黃嘌呤含量表明增加的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且因此這些代謝物是用于評估氧化 應(yīng)激反應(yīng)的有用的生物標(biāo)記。例如，頭皮肩患者的黃嘌呤基線含量相比于無頭皮肩組具有 13. 72倍的黃嘌呤增加（p〈0. 05)，其中在用ZPT去頭皮肩治療三周后的頭皮肩患者的黃嘌 呤含量相比于基線顯著減少（〇. 16倍變化（即，84%的減少），p〈0. 05)，并且相比于無頭皮 肩組無顯著不同，表明頭皮肩病癥已經(jīng)得到改善。用硫化硒進(jìn)行的另一個(gè)去頭皮肩治療具 有與用ZPT治療相似的黃嘌呤倍數(shù)變化模式。對于硫化硒治療組，頭皮肩患者的黃嘌呤基 線含量相比于無頭皮肩組具有15. 96倍的黃嘌呤增加（p〈0. 05)，其中在用硫化硒去頭皮肩