區(qū)分兒童潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患者的蛋白特征譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中區(qū)分兒童潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患者的蛋 白特征譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病（Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis， MTB)感染引發(fā)的慢性傳染性疾病，具有流行性廣、病死率高等特點，嚴重威脅人類健康。近 年來，隨著艾滋病以及耐藥結(jié)核菌的流行，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率居高不下。2012年世界 衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明：2011年全球新增結(jié)核病患者870萬，因結(jié)核病或其并發(fā)癥死亡的 人數(shù)多達140萬，其中兒童結(jié)核病約占全球結(jié)核病負擔(dān)的五分之一。中國是結(jié)核病的重災(zāi) 區(qū)，不僅是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴重的國家 之一。結(jié)核病人數(shù)位居全球第2位，每年新增結(jié)核病患者超過100萬人，其中超過11萬病 例呈現(xiàn)不同程度的耐藥。結(jié)核病防治形勢十分嚴峻。
[0003] 在群體中，只有約10 %的個體在感染MTB后發(fā)展為活動性結(jié)核病（Active tuberculosis，ATB)，活動性結(jié)核病是指結(jié)核病處在活動期，呈現(xiàn)低熱和結(jié)核中毒癥狀，具 有傳染性，須進行隔離和嚴格的抗結(jié)核治療。大部分個體感染MTB后呈現(xiàn)帶菌生存狀態(tài)，并 不會發(fā)展為ATB，稱為潛伏結(jié)核感染（Latenttuberculosisinfection,LTBI)。潛伏結(jié)核 感染雖然不表現(xiàn)任何結(jié)核病的臨床癥狀，但具有發(fā)展為活動性結(jié)核病的風(fēng)險。約有10%的 潛伏結(jié)核感染者在其一生中會發(fā)展為活動性結(jié)核病，如此龐大數(shù)目的潛伏結(jié)核感染者是活 動性結(jié)核病的重要來源。因此，有效地區(qū)別診斷潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患者，并給 予及時相應(yīng)的疾病監(jiān)控甚至是預(yù)防性治療，防止?jié)摲Y(jié)核感染者發(fā)展成為活動性結(jié)核病患 者，是防治結(jié)核病的關(guān)鍵之一。
[0004]目前針對TB的臨床診斷，其金標(biāo)準(zhǔn)仍然是經(jīng)典的痰涂片染色顯微鏡下查找抗酸 桿菌以及結(jié)核桿菌培養(yǎng)法，已有近百年的歷史。這兩種檢測方法的敏感性均不高，痰涂片染 色法的敏感性約30%，MTB培養(yǎng)法的敏感性約60%，且在兒童TB中的敏感度更低，僅有不 到20%。痰涂片染色法雖然可以當(dāng)天出結(jié)果，但不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌，也不能 區(qū)分活菌還是死菌。MTB培養(yǎng)法的敏感性雖高一些，但耗時較長，即使快速培養(yǎng)也需要1個 月的時間才能得到結(jié)果。另外，對于肺外結(jié)核和涂陰、菌陰的結(jié)核病，金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的應(yīng) 用受到限制，加劇了診斷的困難，給及時治療帶來了阻力。近年來雖然陸續(xù)出現(xiàn)了一些先進 的基于核酸擴增的分子生物學(xué)檢測技術(shù)（如XpertMTB/RIFassay)，但由于受到儀器設(shè)備 和診斷費用的限制，以及假陽性率偏高等問題，還無法全面推廣。臨床上沿用已久的結(jié)核菌 素皮試實驗（TST)，容易受到既往BCG疫苗接種和非結(jié)核分枝桿菌感染的干擾。特別是在 我國，嬰兒出生后即會接種卡介苗，導(dǎo)致TST結(jié)果假陽性偏多，診斷不夠明確。新近推行的 γ-干擾素釋放試驗，雖然能夠檢測MTB感染，但無法區(qū)分潛伏結(jié)核感染和活動性結(jié)核病。 因此，現(xiàn)行的ΤΒ診斷方法或輔助診斷手段都無法實現(xiàn)快速有效的鑒別診斷結(jié)核病，使得臨 床上面臨嚴重的治療延誤以及治療性診斷等問題。因此，尋找新的結(jié)核病特異標(biāo)志物，區(qū) 別診斷潛伏結(jié)核感染和活動性結(jié)核病，已經(jīng)成為結(jié)核病臨床診斷中一項亟待解決的難題。
[0005] 機體感染MTB后成為潛伏結(jié)核感染或者發(fā)展為活動性結(jié)核病，是由免疫系統(tǒng)與病 原菌間的相互作用決定的。雖然已經(jīng)確認宿主免疫系統(tǒng)在決定感染結(jié)局方面起到重要的作 用，但目前參與這一過程的基因類別和分子機制尚未得到闡明。從潛伏結(jié)核感染發(fā)展到活 動性結(jié)核病，宿主體內(nèi)必然會經(jīng)歷一系列基因及蛋白表達的改變，其中表達變化較顯著的 一些基因和蛋白無疑會成為區(qū)別診斷潛伏結(jié)核感染和活動性結(jié)核病的特異分子標(biāo)識。既往 研究探討了在潛伏結(jié)核感染和活動性結(jié)核病中，某些細胞因子或趨化因子的表達變化。但 這些研究均基于已知的免疫應(yīng)答信息，檢測的數(shù)量較少，著眼點也比較局限。同時由于兒童 免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，在MTB中參與的基因及蛋白的表達變化可能與成人有所不同。因 此，分別針對不同年齡階段的患者篩選疾病特異性的診斷標(biāo)記物，將具有更好的臨床應(yīng)用 價值和實際意義。
[0006] 蛋白質(zhì)組學(xué)是在1994年由Williams和Wilkins提出的，通過尋找特異性蛋白質(zhì)， 為研究疾病機制提供線索。近年來隨著人類蛋白質(zhì)組學(xué)計劃的全面啟動，蛋白質(zhì)組學(xué)的研 究也產(chǎn)生了巨大進展，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用的定量方法主要有兩種，一種是基于傳統(tǒng)雙 向凝膠電泳及染色基礎(chǔ)上的定量，另外一種是基于質(zhì)譜檢測技術(shù)的定量，包括標(biāo)記定量 技術(shù)（iTRAQ)和非標(biāo)記定量技術(shù)（Labelfreequantification)兩種。非標(biāo)記定量技術(shù) (Label-freequantification)不需要昂貴的同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，實驗耗費低；對樣本 的操作也最少，從而使其最接近原始狀態(tài)；并且不受樣品條件的限制，克服了標(biāo)記定量技術(shù) 在對多個樣本進行定量方面的缺陷，因此它在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及診斷標(biāo)志物篩選 中受到了眾多科學(xué)工作者的推崇，得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何區(qū)分兒童潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患 者。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測12種蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)在制備區(qū) 分或輔助區(qū)分兒童潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所提供的檢測12種蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)在制備區(qū)分或輔助區(qū)分兒童潛伏結(jié) 核感染者和活動性結(jié)核病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用中，所述12種蛋白質(zhì)為TSSK4、LOX、RASGRF2、 XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、NKD2、OCRL、ATG2B和PCF11。
[0010] 所述12種蛋白質(zhì)構(gòu)成了區(qū)分兒童潛伏結(jié)核感染者和活動性結(jié)核病患者的蛋白特 征譜，所述特征譜中差異表達的蛋白質(zhì)為表達上調(diào)的蛋白質(zhì)和表達下調(diào)的蛋白質(zhì)；與兒童 活動性結(jié)核病患者相比較，兒童潛伏結(jié)核感染者中所述表達上調(diào)的蛋白質(zhì)為TSSK4、L0X和 RASGRF2，所述表達下調(diào)的蛋白質(zhì)為XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、NKD2、0CRL、ATG2B 和PCF11 ;與兒童潛伏結(jié)核感染者相比較，兒童活動性結(jié)核病患者中所述表達下調(diào)的蛋白 質(zhì)為TSSK4、L0X和RASGRF2，所述表達上調(diào)的蛋白質(zhì)為XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、 NKD2、OCRL、ATG2B和PCF11。
[0011] 上述應(yīng)用中，所述檢測蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)可包括利用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián) 質(zhì)譜檢測蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述檢測蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)還可包括進行蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的 定量和/或蛋白質(zhì)的酶解所需的試劑和/或儀器。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述檢測蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)還可包括數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所述數(shù)據(jù)處理 系統(tǒng)用來依據(jù)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜的檢測結(jié)果確定所述12種蛋白質(zhì)的含量。所 述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可為進行數(shù)據(jù)分析所需的軟件或模塊，如提取一級質(zhì)譜定量信息的軟件或 模塊、進行蛋白質(zhì)定量的軟件或模塊或進行數(shù)據(jù)檢索和整合的軟件或模塊。所述提取一級 質(zhì)譜定量信息的軟件或模塊可為Trans-ProteomicPipeline軟件，所述進行蛋白質(zhì)定量的 軟件或模塊可為ProfileAnalysis2. 0軟件，所述進行數(shù)據(jù)檢索和整合的軟件或模塊可為 ProteinScape2. 1軟件。
[0014] 所述檢測蛋白質(zhì)含量的系統(tǒng)可只由檢測蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器組成， 也可由檢測蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器與下述A1、A2、A3和A4中的至少一種組成：
[0015]A1、進行蛋白質(zhì)的提取所需的試劑和/或儀器；
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