>[0032](1)脫水與透明程序:80%乙醇處理2h、90%乙醇處理75min、第一次95%乙醇處理45min、第二次95%乙醇處理lh、第一次100%乙醇處理30min、第二次100%乙醇處理30min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理30min、再用第一次二甲苯處理15min、第二次二甲苯處理15min使之透明；
[0033](2)浸蠟與包埋:用體積比為1:1的二甲苯:純石蠟預(yù)處理30min、再第一次純石蠟透蠟90min、第二次純石蠟透蠟90min，將組織樣品用小紙盒進(jìn)行包埋；
[0034](3)切片與展片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在6 μ m，經(jīng)37°C水浴鍋中展片，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片后，在37°C的烘箱中進(jìn)行烘片；
[0035](4)染色、封片與觀察:染色采用H.E染色方法，具體步驟如下:第一次二甲苯處理15min、第二次二甲苯處理13min、用體積比為1:1的二甲苯:無水乙醇過渡處理2min、第一次100 %乙醇處理2min、第二次100 %乙醇處理2min、第一次95 %乙醇處理2min、第二次95%乙醇處理2min、80%乙醇處理2min、70%乙醇處理2min、蘇木精染色20min、自來水沖洗3min、l%鹽酸酒精溶液處理5s、水洗后氨水15s、再水洗、70%乙醇處理3min、80%乙醇處理3min、90%乙醇處理3min、伊紅染色30s、95%乙醇處理4min、第一次100%乙醇處理4min、第二次100%乙醇處理4min、用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理5min、再用第一次二甲苯處理5min、第二次二甲苯處理5min使之透明，然后用中性樹膠封片，封片是輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)的氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片及樣品移位，影響觀察，待樣片中的樹膠在烘箱中烘干后，用刀片刮去多余的樹膠。
[0036]由附圖1和附圖2可以看出，使用本實施1的制片方法得到的石蠟切片容易切片，且完整連片，無殘缺、重疊，組織結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，無假象，脂肪細(xì)胞界線清楚，染色對比明顯，未見灰染。
[0037]對比實施1:
[0038]1、材料固定于預(yù)處理
[0039]將黃石爬銚皮膚取下后，用生理鹽水清洗后，將皮膚修成lcmX0.5cmX0.5cm大的組織，投入波恩氏液中固定至少24h后，保存在70 %乙醇中2h。
[0040]2、石蠟組織切片的制作與觀察
[0041](1)脫水與透明程序:濃度為70%的乙醇處理3h、80%的乙醇處理3h、90%的乙醇處理3h、第一次95%乙醇處理3h、第二次95%乙醇處理3h、第一次100%乙醇處理3h、第二次100 %乙醇處理2h ;然后第一次二甲苯處理45min、第二次二甲苯處理30min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理30min，使之透明；
[0042](2)浸蠟與包埋:用體積比為1:1的二甲苯:純石蠟過渡處理lh、再第一次純石蠟透蠟2h、第二次純石蠟2h，將組織樣品用小紙盒進(jìn)行包埋；
[0043](3)切片與展片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在6μπι，經(jīng)37°C水浴鍋中進(jìn)行展片，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片后，在37°C的烘箱中進(jìn)行烘片；
[0044](4)染色、封片與觀察:染色采用H.E染色方法，具體步驟如下:第一次二甲苯處理15min、第二次二甲苯處理13min、用體積比為1:1的二甲苯:無水乙醇過渡處理2min、第一次100 %乙醇處理2min、第二次100 %乙醇處理2min、第一次95 %乙醇處理2min、第二次95%乙醇處理2min、80%乙醇處理2min、70%乙醇處理2min、蘇木精染色20min、自來水沖洗3min、l%鹽酸酒精溶液處理5s、水洗后氨水15s、再水洗、70%乙醇處理3min、80%乙醇處理3min、90%乙醇處理3min、伊紅染色30s、95%乙醇處理4min、第一次100%乙醇處理4min、第二次100%乙醇處理4min、用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理5min、再用第一次二甲苯處理5min、第二次二甲苯處理5min使之透明，然后用中性樹膠封片，封片是輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)的氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片及樣品移位，影響觀察，待樣片中的樹膠在烘箱中烘干后，用刀片刮去多余的樹膠。
[0045]如圖3所示，傳統(tǒng)時間較長脫水包埋實施例條件下，制作的切片，不完整，有大量殘缺、重疊，組織結(jié)構(gòu)不清晰；由圖4所示，有表皮層脫離的情況出現(xiàn)。證明，傳統(tǒng)方法不適于用于制作黃石爬銚皮膚石蠟切片。
【主權(quán)項】
1.一種黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，由樣品固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片與展片、染色與封片五個步驟組成，其特征在于:在樣品固定后，經(jīng)流水沖洗1.5-2.5h后再進(jìn)行脫水處理；脫水與透明、浸蠟與包埋的總時間為12.5h。2.如權(quán)利要求1所述的黃石爬銚皮膚的石蠟切片制作方法，其特征在于:所述樣品固定步驟為將石爬銚皮膚取下后，用生理鹽水清洗后，將皮膚修成lcmX0.5cmX0.5cm大小的組織，投入波恩氏液中固定。3.如權(quán)利要求1所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其特征在于所述脫水與透明步驟為用梯度乙醇脫水:先后采用濃度為70%的乙醇處理2-12h、80%的乙醇處理1.8-2.2h、90%的乙醇處理70-80min、第一次95%的乙醇處理40_50min、第二次95 %的乙醇處理0.8-1.2h、第一次100%的乙醇處理25-35min、第二次100%的乙醇處理25_35min ；然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯透明預(yù)處理25-30min、再用二甲苯處理2次，每次10-20min，使之透明。4.如權(quán)利要求3所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其特征在于所述脫水與透明步驟為用梯度乙醇脫水:先后采用濃度為70%的乙醇處理2h、80%的乙醇處理2h、90 %的乙醇處理75min、第一次95 %的乙醇處理45min、第二次95 %的乙醇處理lh、第一次100%的乙醇處理30min、第二次100%的乙醇處理30min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯透明預(yù)處理30min、再用二甲苯處理2次，每次15min，使之透明。5.如權(quán)利要求1所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述浸蠟與包埋步驟為用體積比為1:1的二甲苯:石蠟進(jìn)行浸蠟預(yù)處理25-35min ;再用純石蠟浸蠟2次，每次85_95min ;最后將組織樣品用紙盒進(jìn)彳丁包埋。6.如權(quán)利要求5所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其具體特征在于:所述浸蠟與包埋步驟為用體積比為1:1的二甲苯:石蠟浸蠟預(yù)處理30min ;再用純石蠟浸蠟2次，每次90min，最后將組織樣品用紙盒進(jìn)彳丁包埋。7.如權(quán)利要求1所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述切片與展片步驟為用切片機(jī)切片，切片厚度控制在5 μ??-7 μπι，經(jīng)35°C -38°C水浴鍋中進(jìn)行展片，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片后，在35°C _38°C的烘箱中進(jìn)行烘片。8.如權(quán)利要求1所述的黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述染色與封片步驟中染色采用H.E染色方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種黃石爬鮡皮膚石蠟切片的制作方法。由樣品固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片與展片、染色與封片五個步驟組成，在樣品固定后，經(jīng)流水沖洗1.5-2.5h后再進(jìn)行脫水處理；從脫水與包埋時間縮短至12.5h，本發(fā)明的制作方法用流水沖洗處理既方便又節(jié)約成本，且脫水至包埋時間比常規(guī)時間短，花較少的時間完整地切除黃石爬鮡皮膚組織，避免了皮膚組織易碎的缺點，有利于大規(guī)模進(jìn)行石蠟切片制作及對黃石爬鮡皮膚組織結(jié)構(gòu)的研究。
【IPC分類】G01N1/30, G01N1/28
【公開號】CN105241698
【申請?zhí)枴緾N201510621119
【發(fā)明人】趙柳蘭, 李冬梅, 楊淞, 杜宗君, 王艷, 周劍, 劉婭, 杜軍
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月25日