一種黃石爬鮡皮膚石蠟切片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種黃石爬銚皮膚石蠟切片的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃石爬跳(Euchiloglaniskishinouyei Kimu-ra)，屬鲇形目(Siluriformes)、跳科(Sisoridae)、石爬銚屬(Euchiloglanis Regan)，主要分布于長(zhǎng)江流域的眠江水系和金沙江水系，海拔1800-3600m處，是高山峽谷，陡坡急流及枯洪流量的環(huán)境中生活的小型底棲淡水魚(yú)類(諸新洛等1999，唐文家等2011)，并且是鰌銚魚(yú)類除原銚外，最為原始的種類，因其生態(tài)分布的特殊性，是研究魚(yú)類進(jìn)化及系統(tǒng)分類學(xué)重要材料。由于酷捕，黃石爬銚的天然資源量急劇減少，已處于瀕危狀態(tài)，亟待采取有效措施加以保護(hù)(郭憲光等2004，汪搖松等 2004)。
[0003]為研究黃石爬銚皮膚的基本結(jié)構(gòu)及其粘液細(xì)胞在魚(yú)體皮膚里的分布情況，為探討外界環(huán)境對(duì)魚(yú)體生理機(jī)能的影響提供一些直觀的參考，需要對(duì)黃石爬銚皮膚作石蠟切片。但由于黃石爬銚皮膚真皮層中富含有脂肪，制作石蠟切片時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)破碎、擠壓或切片不完整的現(xiàn)象，且傳統(tǒng)石蠟切片的制作時(shí)間長(zhǎng)，染色效果不理想，為了解決這一問(wèn)題就需要對(duì)常規(guī)的石蠟切片制作方法進(jìn)行改進(jìn)。
[0004]中國(guó)專利(CN103257055A)公開(kāi)的一種三角帆蚌外套膜組織切片的制備方法，組織酒精梯度脫水時(shí)省去了 95%酒精的梯度，浸蠟時(shí)間也減少，大大縮短了傳統(tǒng)的制作切片的時(shí)間，但此方法對(duì)于富含有脂肪的黃石爬銚皮膚真皮層石蠟切片的制作沒(méi)有作用，且省去95%酒精梯度對(duì)皮膚脫水不徹底，造成組織破碎，真皮層與表皮層脫離等問(wèn)題，導(dǎo)致黃石爬銚皮膚組織切片的失敗。因此，如何調(diào)整脫水和浸蠟時(shí)間，是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是黃石爬銚皮膚真皮層中富含有脂肪，制作石蠟切片時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)破碎、擠壓或切片不完整的現(xiàn)象，且傳統(tǒng)皮膚切片的制作時(shí)間長(zhǎng)，染色效果不理雄
vQjN Ο
[0006]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn):包括方法的篩選、條件的優(yōu)化及重復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了一整套的適用于黃石爬銚皮膚切片的材料固定、處理和組織切片方法，包括樣品固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片與展片、染色與封片五個(gè)步驟，且在樣品固定后，經(jīng)流水沖洗1.5-2.5h后再進(jìn)行脫水處理；脫水與透明、浸蠟與包埋的總時(shí)間，即從組織脫水到組織包埋只需要12.5h。
[0007]進(jìn)一步的，所述樣品固定步驟為將黃石爬銚皮膚取下后，用生理鹽水清洗后，將皮膚修成lcmX0.5cmX0.5cm大小的組織，投入波恩氏液中固定。所述波恩氏液的配方為:苦味酸飽和水溶液75ml，福爾馬林(40 %甲醛液)25ml，冰醋酸5ml。
[0008]進(jìn)一步的，所述脫水與透明步驟為用梯度乙醇脫水:先后采用濃度為70%的乙醇處理2-12h、80%的乙醇處理1.8-2.2h、90%的乙醇處理70_80min、第一次95 %的乙醇處理40-50min、第二次95 %的乙醇處理0.8-1.2h、第一次100 %的乙醇處理25_35min、第二次100%的乙醇處理25-35min ;然后用體積比為1:1的無(wú)水乙醇:二甲苯透明預(yù)處理25-30min、再用二甲苯處理2次，每次10_20min，使之透明。
[0009]優(yōu)選為先后采用濃度為70 %的乙醇處理2h、80 %的乙醇處理2h、90 %的乙醇處理75min、第一次95 %的乙醇處理45min、第二次95 %的乙醇處理lh、第一次100 %的乙醇處理30min、第二次100%的乙醇處理30min ;然后用體積比為1:1的無(wú)水乙醇:二甲苯透明預(yù)處理30min、再用二甲苯處理2次，每次15min使之透明。
[0010]進(jìn)一步的，所述浸蠟與包埋步驟為用體積比為1:1的二甲苯:石蠟進(jìn)行浸蠟預(yù)處理25-35min ;再用純石蠟浸蠟2次，每次85_95min ;最后將組織樣品用紙盒進(jìn)行包埋。
[0011]優(yōu)選為所述浸蠟與包埋步驟為用體積比為1:1的二甲苯:石蠟浸蠟預(yù)處理30min ;再用純石蠟浸蠟2次，每次90min，最后將組織樣品用紙盒進(jìn)行包埋。
[0012]進(jìn)一步的，所述切片與展片步驟為用切片機(jī)切片，切片厚度控制在5 μπι-7μπι，經(jīng)35°C _38°C水浴鍋中進(jìn)行展片，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片后，在35°C _38°C的烘箱中進(jìn)行烘片。
[0013]進(jìn)一步的，所述染色與封片步驟中染色采用Η.E染色方法。具體步驟如下:先用第一次二甲苯處理10_15min、第二次二甲苯處理10_13min、再用體積比為1:1的二甲苯:無(wú)水乙醇處理2min、第一次100%的乙醇處理2min、第二次100%的乙醇處理2min、第一次95 %的乙醇處理2min、第二次95 %的乙醇處理2min、80 %的乙醇處理2min、70 %的乙醇處理2min、蘇木精染色20min、自來(lái)水沖洗3min、1 %鹽酸酒精溶液處理5s、水洗后氨水處理15s、再水洗、70%的乙醇處理3min、80%的乙醇處理3min、90%的乙醇處理3min、伊紅染色30s、95 %的乙醇處理4min、第一次100 %的乙醇處理4min、第二次100 %的乙醇處理4min、用體積比為1:1的無(wú)水乙醇:二甲苯處理5min、第一次二甲苯處理5min、第二次二甲苯處理5min使之透明，然后用中性樹(shù)膠封片。
[0014]所述的蛋白甘油優(yōu)選為體積比1:1的用紗布過(guò)濾的蛋清:甘油。
[0015]所述的蘇木精染液配方為:Hansen氏蘇木素液
[0016]甲液:lg蘇木素，10ml無(wú)水酒精；乙液:20g硫酸招鉀(鉀明鞏)，200ml蒸饋水；丙液:lg高錳酸鉀，16ml蒸餾水；
[0017]先將甲液加熱溶解，然后將乙液加熱溶解，將甲、乙兩液混合。再將丙液溶解后緩緩滴入，待全部混合后，再次煮沸一分鐘，冷卻后過(guò)濾，即可使用。
[0018]所述的伊紅染液優(yōu)選為1 %的伊紅染液，0.5-1 g伊紅(醇溶)用99ml濃度為95%的乙醇溶解。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:
[0020](1)常規(guī)傳統(tǒng)的石蠟切片的制作，從脫水到包埋需要經(jīng)過(guò)20-35h，由于皮膚結(jié)構(gòu)的特殊性，皮膚內(nèi)脂肪含量較高，傳統(tǒng)皮膚脫水時(shí)間和浸蠟時(shí)間都會(huì)在此基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)以獲得較好的制片效果；本發(fā)明針對(duì)了黃石爬銚皮膚較薄，無(wú)鱗的特性進(jìn)行調(diào)整，將脫水與透明、浸蠟與包埋的總時(shí)間縮短至12.5h，制得清晰完整切片，組織和細(xì)胞相對(duì)固定，便于觀察。
[0021 ] (2)本發(fā)明在樣品固定后，經(jīng)流水沖洗后再進(jìn)行脫水處理，比較用PBS或50 %酒精沖洗更加節(jié)省成本，利于后期大量制作切片，增大了制作黃石爬銚皮膚的成功率。
[0022](3)為制作黃石爬銚皮膚的石蠟切片提供一種可行高效的制作方法，有利于大規(guī)模進(jìn)行后期的皮膚粘液細(xì)胞染色等其他免疫組化方法處理對(duì)黃石爬銚皮膚組織結(jié)構(gòu)的研究。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1得到的黃石爬銚皮膚組織圖；
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1得到的黃石爬銚皮膚組織放大圖；
[0025]圖3是本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例1得到的黃石爬銚皮膚組織圖1 ;
[0026]圖4是本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例1得到的黃石爬銚皮膚組織圖1I。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為使本發(fā)明實(shí)施的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]1、材料固定與預(yù)處理
[0030]將黃石爬銚皮膚取下后，用生理鹽水清洗，將皮膚修成lcmX0.5cmX0.5cm大的組織，投入波恩氏液中固定至少24h后，用流水沖洗2h后，保存在70%乙醇中2h。
[0031]2、石蠟組織切片的制作與觀察