一種檢查布洛芬原料細(xì)菌內(nèi)毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法，具體的說是涉及一種檢查布洛芬原料細(xì)菌內(nèi) 毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 布洛芬具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用。適用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨 關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎和神經(jīng)炎等。細(xì)菌內(nèi)毒素是注射劑藥品中的主要污染物質(zhì)，大量進(jìn)入 血液就會(huì)引起發(fā)熱反應(yīng)一"熱原反應(yīng)"，危害人體健康，甚至危及生命，故注射劑需要檢查細(xì) 菌內(nèi)毒素。布洛芬作注射劑藥物的原料時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查控制，為了臨床安全用 藥，內(nèi)毒素限值L控制在0. 035EU/mg。按張德波在"布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究"文獻(xiàn) (中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)2012, 29 (3) :261~264)中報(bào)道的檢查布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素的方法：布 洛芬樣品中加入1. 5倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后檢查內(nèi)毒 素，該方法的內(nèi)毒素限值L為0. 20EU/mg。當(dāng)布洛芬內(nèi)毒素限值L為0. 035EU/mg,采用張德 波的文獻(xiàn)方法檢測，供試品陽性對照呈陰性，說明供試品溶液干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。布洛 芬在水中幾乎不溶，在乙醇中易溶，但是乙醇會(huì)干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。因此需要采用一種 既能溶解樣品，又能使供試品溶液不影響內(nèi)毒素檢查的方法進(jìn)行用于注射劑產(chǎn)品的布洛芬 原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種檢查布洛芬原料的細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù) 存在的問題。
[0004] 本發(fā)明的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，包括以下步驟：稱取布洛芬原料和1/4~1/2倍量 無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉，用15~45% (v/v)的乙醇溶液制成不低于14. 28mg/ml的布洛芬 溶液，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋制備各靈敏度鱟試劑對應(yīng)的布洛芬溶液，然后參照《中 國藥典》2010年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法檢查。
[0005] 本發(fā)明人經(jīng)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，采用15~45% (v/v)的乙醇溶液和1/4~1/2倍量無 內(nèi)毒素的無水碳酸鈉既可解決布洛芬原料的溶解性問題，又能避免樣品溶液對布洛芬內(nèi)毒 素檢查的干擾，可以用于檢查內(nèi)毒素限值L為0. 035EU/mg的布洛芬原料。
[0006] 本發(fā)明提供的布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，操作簡便，靈敏準(zhǔn)確，完全能滿足布洛芬 作為注射劑原料檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的要求。
[0007]
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例1 1儀器與試藥 1. 1儀器 電熱恒溫水浴鍋（上海儀表集團(tuán)供銷公司）、XW-80A旋渦混合器(上海青浦滬西 儀器廠)、潔凈工作臺(tái)（ffiNG ZI)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠)、電子天平 (sartorius)，試驗(yàn)所用玻璃器皿均在250°C烘烤2h，以去除可能存在的外源性細(xì)菌內(nèi)毒 素。
[0009] 1. 2 試藥 鱟試劑（TAL，湛江安度斯生物有限公司，0. lml/支，靈敏度0. 25EU/ml，批號(hào)：1206201 ; 湛江博康海洋生物有限公司，〇. lml/支，靈敏度0. 25EU/ml，批號(hào)：1206130 ;湛江安度斯生 物有限公司，〇. lml/支，靈敏度0.06EU/ml，批號(hào)：1207082 ;湛江博康海洋生物有限公司， 〇. lml/支，靈敏度0.06EU/ml，批號(hào)：1207131);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國藥品生物 制品檢定所，規(guī)格：120EU/支，批號(hào)：150601-201072);乙醇；無水碳酸鈉；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，50ml/瓶，批號(hào)：1010140);布洛芬原料（市售）。
[0010] 2布洛芬原料的細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 布洛芬內(nèi)毒素限值L計(jì)算，L=0. 375EU/mg (K=5EU/kg .h，M=13. 33mg/kg .h)，根據(jù)制成 的布洛芬注射液的內(nèi)毒素的限度，并考慮到還有加入其他輔料，為了保證布洛芬注射液的 臨床用藥的安全性，將原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為L=0. 035EU/mg。
[0011] 3最小有效稀釋濃度（MVC)的計(jì)算 最小有效稀釋濃度計(jì)算公式為：MVC=X/L，其中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，布洛 芬原料的L為0.035EU/mg。入為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，當(dāng)入為0. 25EU/ml、 0? 125EU/ml、0. 06EU/ml或0? 03EU/ml時(shí)，相對應(yīng)的最小有效稀釋濃度如表1 : 表1最小有效稀釋濃度
4布洛芬原料溶解方法選擇 布洛芬內(nèi)毒素限值為L=0. 035EU/mg，按靈敏度為0. 03EU/ml的鱟試劑計(jì)算，稱取布 洛芬約57. 12mg，加入4ml乙醇溶液和一定量無水碳酸鈉溶解樣品，制備成濃度不低于 14. 28mg/ml的布洛芬溶液，只有在不低于14. 28mg/ml的濃度下，才能逐步用細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查用水稀釋制備濃度不低于各靈敏度對應(yīng)的最小有效稀釋濃度的供試品溶液，并測定 0? 86mg/ml的供試品溶液的pH，結(jié)果如表2。
[0012] 表2布洛芬溶解方法及pH
由于方案1、5不能將布洛芬完全溶解，因此排除這兩種溶解方法，方案7的pH不在6~ 8范圍內(nèi)，干擾內(nèi)毒素檢查，因此乙醇濃度篩選為15~45%(v/v)，無水碳酸鈉用量為1/4~ 1/2倍布洛芬稱樣量。
[0013] 對比實(shí)施例 布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為0. 035EU/mg時(shí)，采用張德波在"布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 研究"文獻(xiàn)（中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)2012, 29 (3) :261~264)中報(bào)道的檢查布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素 的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3。
[0014] 表3布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果
注：" + "表示反應(yīng)為陽性，""表示反應(yīng)為陰性。
[0015] 結(jié)論：供試品陽性對照呈陰性，說明采用此方法供試品溶液干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
[0016] 實(shí)施例2 1乙醇溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑凝集反應(yīng)的干擾試驗(yàn) 表4乙醇溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑凝集反應(yīng)的干擾試驗(yàn)
注："+"表示反應(yīng)為陽性，""表示反應(yīng)為陰性。
[0017] 結(jié)論：45%和15%的乙醇溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑凝集反應(yīng)無干擾。
[0018] 2鱟試劑靈敏度復(fù)核 按2010年版中國藥典二部附錄XI E的要求對鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核，用細(xì)菌內(nèi)毒檢查 用水溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2 A、A、0. 5入、 0. 25 A濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s，各批取復(fù)溶后 的0. lml/支的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0. lml上述不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 溶液，每個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管。另外2管加入0. lml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對 照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口垂直放入（37±1) °C的恒溫水浴鍋保溫（60±2) 分鐘。結(jié)果見表5。
[0019] 表5鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)
注：" + "表示反應(yīng)為陽性，""表示反應(yīng)為陰性。
[0020] 結(jié)論：經(jīng)復(fù)核，所用鱟試劑的靈敏度測定值均在0.5入~2入之間（包括0.5X和 2入），符合規(guī)定。
[0021] 3干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 布洛芬原料做干擾預(yù)試驗(yàn)，分別用溶媒1 (45%的乙醇溶液和1/4倍量無內(nèi)毒素的無水 碳酸鈉的混合溶液）和溶媒2 (15%的乙醇溶液和1/2倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉的混合 溶液）溶解樣品，經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，并適當(dāng)超聲，逐級(jí)稀釋制得7. 14mg/ml、3. 57 mg/ml、l. 71mg/ml、0. 86mg/ml系列稀釋液作為供試品陰性對照。另配制與NPC相同濃度梯 度的供試品溶液，每個(gè)濃度均制備含2 X細(xì)菌內(nèi)毒素的系列溶液作為供試品陽性對照，每 個(gè)濃度平行做兩管，同時(shí)作陽性對照、陰性對照。分別取兩個(gè)廠家〇. 25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行 試驗(yàn)，見表6。
[0022] 表6布洛芬干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果
注：" + "表示反應(yīng)為陽性，" "表示反應(yīng)為陰性。
[0023] 由表6結(jié)果可知，布洛芬溶液對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)有抑制作用，但當(dāng)質(zhì) 量濃度稀釋至1. 71mg/ml及以下時(shí)，其抑制作用可以被排除，該濃度對應(yīng)的鱟試劑靈敏度 為 0? 06EU/ml。
[0024] 4正式干擾試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇兩個(gè)廠家為0. 〇6EU/ml的鱟試劑，布洛芬稀釋至1. 71mg/ml的濃 度作為供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。分別用溶媒1 (45%的乙醇溶液和1/4倍量無內(nèi)毒素的 無水碳酸鈉的混合溶液)和溶媒2 (15%的乙醇溶液和1/2倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉的混 合溶液）溶解樣品，經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，制備含2 A、A、0. 5 A、0. 25 A的細(xì)菌內(nèi)毒 素系列溶液，每一濃度平行做4管。并用BET水制備含2入、入、0.5入、0. 25入的細(xì)菌內(nèi)毒 素系列溶液，每一濃度平行做4管。同時(shí)作陰性對照、供試品陰性對照，各平行做兩管。結(jié) 果見表7。
[0025] 表7布洛芬干擾試驗(yàn)結(jié)果
注："+"表示反應(yīng)為陽性，""表示反應(yīng)為陰性。
[0026] 根據(jù)表7結(jié)果表明，陰性對照管、供試品陰性對照管，結(jié)果均為陰性。兩組鱟試劑 的Es為0? 06EU/ml，在0? 5 X~2 X之間（包括〇? 5 X和2 X )，Et在0? 5Es~2Es之間 (包括0. 5 Es和Es)，試驗(yàn)有效。說明布洛芬在1. 71mg/ml質(zhì)量濃度時(shí)，對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi) 毒素的凝集反應(yīng)無干擾。
[0027] 5布洛芬細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 取3批布洛芬原料各適量，選擇0. 06EU/ml的鱟試劑，分別用溶媒1(45%的乙醇和1/4 倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉的混合溶液)和溶媒2 (15%的乙醇和1/2倍量無內(nèi)毒素的無水 碳酸鈉的混合溶液)溶解樣品，制備濃度不低于14. 28mg/ml的布洛芬溶液，再用細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查用水稀釋樣品。參照2010年版《中國藥典》二部附錄XI E的要求進(jìn)行檢查。結(jié)果見表 8〇
[0028] 表8布洛芬原料內(nèi)毒素檢查結(jié)果
注：" + "表示反應(yīng)為陽性，" "表示反應(yīng)為陰性。
[0029] 由表8的檢查結(jié)果可知，NPC和NC均為陰性；PPC和PC均為陽性，試驗(yàn)有效。結(jié)果 表明3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測布洛芬原料內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟：稱取布洛芬原料和1/4~1/2 倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉，用15~45% (v/v)的乙醇溶液制成不低于14. 28mg/ml的布 洛芬溶液，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋制備各靈敏度鱟試劑對應(yīng)的布洛芬溶液，然后參 照《中國藥典》2010年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法檢查。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測布洛芬原料細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，所述方法包括：取布洛芬適量，加1/4～1/2倍量無內(nèi)毒素的無水碳酸鈉和15～45%（v/v）的乙醇溶液溶解，經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，采用凝膠法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素。采用本方法可以檢查細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.035EU/mg布洛芬原料的細(xì)菌內(nèi)毒素。本發(fā)明的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度。
【IPC分類】G01N33/15, G01N1/28
【公開號(hào)】CN105203724
【申請?zhí)枴緾N201410293711
【發(fā)明人】何富麗, 賈琳, 段瑞
【申請人】重慶藥友制藥有限責(zé)任公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年6月27日