用于食管癌診斷的標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于食管癌診斷的標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率和死 亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多于 女，發(fā)病年齡多在40歲以上。食管癌典型的癥狀為進(jìn)行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼 而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也不能咽下。食管癌的檢測是有效治療食管癌的基礎(chǔ)。
[0003]目前臨床應(yīng)用的食管癌血清標(biāo)志物主要有鱗狀細(xì)胞癌抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen，SCCA)、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白 19 片段（CYFRA21-1)。但現(xiàn)有的血清學(xué)標(biāo)志物都存在靈敏度和特異性不高的缺點(diǎn)，尤其在食管 癌早期診斷方面更突出。國外報(bào)道，血清CEA診斷早期食管鱗癌的靈敏度僅約為17% [1]， 血清SCCA診斷早期和中晚期食管鱗癌的靈敏度分別為22%和37% [2]。CYFRA21-1診斷早 期和中晚期食管鱗癌的靈敏度分別為22. 2%和77. 8%。國內(nèi)報(bào)道，CEA，Cyfra21-l及SCCA 診斷食管鱗癌的陽性率分別為10. 3%，25. 6%及42. 3% [3]。這些研究均說明傳統(tǒng)的血清腫 瘤標(biāo)志物診斷食管鱗癌的靈敏度均較低。因此，尋找新的血清標(biāo)志物，提高食管鱗癌診斷靈 敏度是近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
[0004]目前篩選新的食管癌血清診斷標(biāo)志物主要采用以下3個(gè)策略： (1)采用表觀遺傳學(xué)篩選血清食管癌特異性甲基化DNA標(biāo)志物的策略=Kuroki等[4]研 究發(fā)現(xiàn)FHIT，⑶KN2A，MGMT，RASSFl等腫瘤相關(guān)基因在食管癌組織中存在異常甲基化，可在 血液中檢測到這些異常甲基化的游離DNA，診斷食管癌的靈敏度為45 %，特異性78 %。Lima 等[5]利用Illumina GoldenGate甲基化芯片比較10對食管癌與癌旁組織的異常甲基化狀 態(tài)，篩選出TFFl作為潛在的腫瘤早期診斷指標(biāo)，靈敏度達(dá)61%。國內(nèi)李波等 [6]從食管癌 組織中篩選出5個(gè)異常甲基化基因pl6,⑶HI, RASSF1A，DAPK和RAR- P，其中⑶HI, DAPK和 RASSF1A存在于在外周血中，診斷食管癌的靈敏度為84. 4%，特異性為86. 7%。李旭峰等[7] 篩選出3個(gè)存在于血液中的異常甲基化基因EPB41L3, GPX3和C0L14A1，聯(lián)合檢測診斷食管 癌的靈敏度64. 3%，特異性達(dá)100%。血液中異常甲基化DNA診斷食管癌的靈敏度和特異 性明顯高于傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物。但其不足之處在于各研究小組篩選出的異常甲基化DNA 各不相同，其診斷效能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外多數(shù)研究未報(bào)道其診斷早期食管癌的靈敏 度，仍有待進(jìn)一步研究，且甲基化DNA檢測技術(shù)復(fù)雜，不易于臨床普遍開展。
[0005] (2)蛋白組學(xué)尋找新的食管癌血清標(biāo)志物策略：近年來采用蛋白組學(xué)技術(shù)，比 較食管癌患者和正常人血清蛋白組的表達(dá)差異，尋找食管癌診斷血清標(biāo)志物。范乃軍等 [8]通過蛋白組技術(shù)在食管癌患者血清中尋找到3個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白，診斷食管癌靈敏度為 60%-70%。劉麗華等 [9]篩選出不同的蛋白組合，其診斷食管癌的靈敏度接近90%。由于 血清中存在高豐度蛋白如白蛋白和IgG，不可避免地干擾低豐度蛋白的檢測，蛋白組技術(shù)對 低豐度蛋白的靈敏度和精密度均不能達(dá)到分析的要求。采用此策略尋找新的食管癌血清診 斷標(biāo)志物，可能會(huì)漏掉一些潛在的有診斷價(jià)值的靶蛋白。
[0006] (3)microRNA芯片篩選新的血清食管癌標(biāo)志物策略：張辰宇等 [1°]采用microRNA 芯片篩選出對食管癌有較高診斷價(jià)值的7種miRNA :miR-10a，miR-22, miR-100, miR-148b，m iR-223，miR-133a 和 miR-127-3p，診斷靈敏度約為 81. 2%，特異性約為 83. 0%。Yamamoto S等[11]也發(fā)現(xiàn)miR-507, -634, -450a，-129-5p與食管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，診斷食管癌靈 敏度約60%。盡管此策略篩選的血清miRNA標(biāo)志物診斷靈敏度較高，特異性也較好，但不同 的研究組篩選的miRNA不同，其診斷價(jià)值也有待驗(yàn)證，并且血清miRNA的檢測技術(shù)要求高， 操作復(fù)雜，大批量測定較麻煩，不適合臨床普遍應(yīng)用。
[0007] 采用以上策略從血清中篩選新的食管癌標(biāo)志物各有其優(yōu)缺點(diǎn)，還不能滿足臨床上 食管癌早期診斷的要求。因此，探索新的策略來篩選更好的食管癌血清診斷標(biāo)志物仍有必 要。
[0008] 眾所周知，食管癌組織和其配對的正常組織差異基因表達(dá)芯片技術(shù)是食管癌血清 標(biāo)志物篩選策略之一。此策略通過芯片技術(shù)尋找高差異表達(dá)的基因，如果存在分泌蛋白，選 擇其中一個(gè)或者其中幾個(gè)差異最顯著的蛋白，然后進(jìn)行血清檢測，驗(yàn)證其能否作為食管癌 診斷標(biāo)志物。日本Zen K等[12]通過表達(dá)芯片技術(shù)篩選出PARD3,在食管癌病人血清中的檢 出率為15%。Takumi Yamabuki等[4]也通過相同技術(shù)篩選出DKK1，其在食管癌患者血清中 的檢出率為63. 0%。差異基因表達(dá)芯片技術(shù)篩選的標(biāo)志物確實(shí)能夠提尚食管癌檢測靈敏 度，然而由于此技術(shù)僅針對已知基因，對低豐度的mRNA檢測較困難，不可避免地造成目的 靶標(biāo)的遺漏，同時(shí)也存在不同研究組篩選的靶標(biāo)不同。
[0009] 近年來，高速發(fā)展的高通量RNA轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可彌補(bǔ)基因表達(dá)芯片上述缺陷。 高通量RNA轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是指利用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行cDNA測序，全面快速地獲 取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。該技術(shù)的優(yōu)勢是能得到高覆 蓋度高精度的轉(zhuǎn)錄本信息，它比表達(dá)基因芯片技術(shù)能夠提供更系統(tǒng)和更全面的mRNA表達(dá) 數(shù)字化信號，更靈敏地檢測到低豐度的mRNA表達(dá)水平。由于mRNA水平顯著高于其對應(yīng)的 蛋白水平，尤其針對蛋白組學(xué)檢測不出的低豐度蛋白，RNA測序技術(shù)可以識別比蛋白組高一 兩個(gè)數(shù)量級的基因，大大提高了檢測的靈敏度，這些特性使其成為篩選診斷腫瘤標(biāo)志物的 良好的技術(shù)方法。
[0010] 然而，現(xiàn)有技術(shù)中，依然缺乏靈敏度高，特異性好的食管癌診斷標(biāo)志，這限制了診 斷標(biāo)志的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于食管癌診斷的組合標(biāo)志物，該組合標(biāo)志物具有靈 敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0012] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一組用于食管癌診斷的標(biāo)志物，由MMP13、CHI3L1、SPPl組成。
[0013] 優(yōu)選的，基于上述標(biāo)志物的診斷公式為 Logit (p = ESCC) = -5. 278+0. 025 X CHI3L1+0. 028XSPP1+0. 747XMMP13, 式中，MMP13、CHI3L1、SPPl表達(dá)量的單位為ng/ml，P值大于0. 43時(shí)定義為高風(fēng)險(xiǎn)，反 之則為低風(fēng)險(xiǎn)。
[0014] 一種用于食管癌診斷的試劑盒，該試劑盒中含有定量MMP13、CHI3L1、SPPl表達(dá)量 的試劑。
[0015] 上述用于食管癌診斷的試劑盒中，風(fēng)險(xiǎn)值根據(jù)公式： Logit(p = ESCC) = -5. 278+0. 025XCHI3L1+0. 028XSPP1+0. 747XMMP13 計(jì)算，式中， MMP13、CHI3L1、SPP1表達(dá)量的單位為ng/ml，P值大于0. 43時(shí)定義為高風(fēng)險(xiǎn)，反之則為低風(fēng) 險(xiǎn)。
[0016] 一種食管癌的早期診斷方法，包括如下步驟： 1) 定量待測組織中MMP13、CHI3L1和SPPl的表達(dá)量； 2) 根據(jù)MMP13、CHI3L1和SPPl的表達(dá)量，確定食管癌的情況。
[0017] 特別的，上述診斷方法中，診斷公式為： Logit (p = ESCC) = -5. 278+0. 025 X CHI3L1+0. 028XSPP1+0. 747XMMP13, 式中，MMP13、CHI3L1、SPPl表達(dá)量的單位為ng/ml，P值大于0. 43時(shí)定義為高風(fēng)險(xiǎn)，反 之則為低風(fēng)險(xiǎn)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明基于CHI3L1，MMP13和SPPl這3個(gè)指標(biāo)建立了診斷食管癌的數(shù)學(xué)模型： Logit(p = ESCC) = -5.278+0.025XCHI3L1+0.028XSPP1+0.747XMMP13,此數(shù)學(xué)模 型預(yù)測概率診斷食管癌的AUC為0. 942。當(dāng)靈敏度定為90%時(shí)，cut-off為0. 4,特異性可 達(dá)76. 04%，陽性預(yù)測值85. 44%，陰性預(yù)測值82. 95%。用于食管癌的早期診斷時(shí)，靈敏度 90. 14%，特異性76. 04%，AUC 0. 933,陽性預(yù)測值73. 56%，陰性預(yù)測值91. 25%，顯著高于 CHI3L1(靈敏度：90. 14% ;特異性：22.92% ;AUC :0.731)，MMP13(靈敏度：90. 14% ;特異性 48. 96 % :AUC :0? 837)，SPPl (靈敏度：90. 14 % ;特異性：14. 58 % ;AUC :0? 7)任何一個(gè)指標(biāo) 單獨(dú)的診斷效能。在驗(yàn)證組中，數(shù)學(xué)診斷模型預(yù)測食管癌AUC為0. 930,當(dāng)靈敏度定為90% 時(shí)，特異性可達(dá)78. 75%，陽性預(yù)測值90. 0%，陰性預(yù)測值79. 75%。而其預(yù)測早期食管癌 AUC為0. 943,當(dāng)靈敏度定為90. 53%時(shí)，特異性可達(dá)88. 75%，陽性預(yù)測值89. 41%，陰性預(yù) 測值 89. 87%。
【附圖說明】
[0019] 圖1是40例食管癌患者和40例正常人血清ADAM12, CA9, CHI3L1，CST1，MMP13、 POSTN、SFRP4、SPP1、LAMC2、SERPINE1 濃度比較情況； 圖2是測試組（150例食管癌患者與96例正常人）中血清ADAM12、CHI3L1、MMP-13、 SPPl濃度比較情況； 圖3是血清ADAM12、CHI3L1、MMP-13、SPPl及數(shù)學(xué)診斷模型診斷測試組中食管癌的 ROC ； 圖4是測試組中71例早期食管癌患者與96例正常人血清CHI3L1、MMP-13、SPPl濃度 比較； 圖5是血清CHI3L1、MMP-13、SPPl及數(shù)學(xué)診斷模型診斷測試組中早期食管癌的ROC ; 圖6是驗(yàn)證組（169例食管癌患者與80例正常人）中血清CHI3L1、MMP-13、SPPl濃度 比較； 圖7是血清CHI3L1、MMP-13、SPPl及數(shù)學(xué)診斷模型診斷驗(yàn)證組中食管癌的ROC ; 圖8是驗(yàn)證組中84例早期食管癌患者與80例正常人血清CHI3L1、MMP-13、SPPl濃度 比較； 圖9是血清CHI3L1、MMP-13、SP