一種快速定量檢測病人血液中百草枯濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種農藥檢測方法，具體涉及一種快速定量檢測血液中百草枯濃度的方法。
【背景技術】
[0002]百草枯(1，L-二甲基-4，4.-二氯二吡啶，PQ )在最近30年隨著PQ成為廣泛使用的除草劑，它所引起的急慢性中毒案例也為數不少。百草枯引起的中毒毒性強，損傷廣泛，而且到目前為止無特效解毒藥物，臨床上病人的預后差，死亡率高，臨床癥狀和損害程度不成比例，所以快速檢測其血中濃度可以給醫(yī)生很大參考價值。
[0003]目前，百草枯濃度的檢測主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、免疫測定法、毛細管電泳法等。這些方法優(yōu)點是靈敏度高，但是也有儀器設備貴，普遍性不高，操作復雜，檢測周期長和成本高。不適于臨床急診應用。專利CN201010197563.6《用于定性檢測百草枯百草枯的試劑和尿液中百草枯的檢測方法》，只給出了定性檢測的方法，只適合于臨床醫(yī)生判斷屬于何種農藥的中毒，而不能提供準確的含量檢測，不能指導臨床醫(yī)生迅速地判斷預后和給予及時的治療措施。CN201110186707.2《一種測定百草枯血藥含量的方法》，經過加入內標物水溶液和蛋白沉淀劑乙腈，混合離心后取上清然后進行HPLC檢測，測定內標物和百草枯的峰面積后，以最小二乘法線形回歸計算出百草枯的血藥濃度。方法非常復雜，所采用的儀器設備也要求高，目前醫(yī)院相關科室配備HPLC的還不多，操作人員素質也要求高。專利CN201010571822.7《一種快速檢測血液中百草枯濃度的試劑盒》，主要由除蛋白的試劑1、除核酸和防干擾的試劑I1、試劑盒溶劑、百草枯標準品和百草枯校準品組成。該試劑盒能夠快速檢測患者血液中百草枯的濃度，為百草枯中毒的臨床診斷和治療提供百草枯快速、簡便、準確、可靠、有效的依據。但組成試劑比較復雜，該方法包含試劑I為凍干固體粉末，含有以重量份的組分有:三氯醋酸1.8-2.2份或磷鎢酸0.89-1.21份、無水醋酸鈉0.23-0.27份、氯化鈉0.11-0.13份或氯化鎂0.09-0.11份；試劑II含有的組分有:9-11 %聚乙二醇或異丙醇或無水乙醇或95%乙醇、19_21mmol/L氯化鎂或45_55mmol/L氯化鋰、0.22-0.26mol/L Tris緩沖液，pH為9.5-10.0，涉及的試劑繁雜，在追求精度和準確的基礎上，反而沒有突出簡便的特點。
[0004]文獻中檢測百草枯中毒的方法也比較多，其中以高效液相色譜法(HPLC)最為常用?！吨袊▽W雜志》2007年第22卷第6期第388-389頁公開的 < 高效液相色譜法測定生物體液中百草枯 > 和《中國法學雜志》2004年第19卷第3期第160-161頁公開的 < 高效液相色譜法測定人血液中的百草枯〉，都是使用離子交換固相萃取法對百草枯血漿樣本進行預處理，存在樣本處理過程復雜且花費時間長的缺點；另外，雖然在流動相中加入了離子對試劑辛烷基磺酸鈉來改善百草枯的峰形，但百草枯色譜峰的拖尾形象依然存在；采用外標法，操作誤差會影響到檢測結果的準確性；百草枯的保留時間為12min左右，超過了 lOmin。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量簡便測定百草枯血藥濃度的方法。
[0006]為了實現以上目的，在兼顧靈敏度和準確性的前提下，本發(fā)明人經過比對和反復試驗，研制出方法簡單，穩(wěn)定可靠，方便快速可定量檢測百草枯濃度的方法。以利于在基層醫(yī)院展開對百草枯濃度的測定工作，方便醫(yī)生更好地搶救病人生命。
[0007]本發(fā)明所述方法主要由以下試劑組成:主要由除蛋白試劑I和試劑II，溶劑III和百草枯標準品IV組成。
[0008]所述試劑I為乙腈，試劑II為20%的三氯醋酸溶液，溶劑III為雙蒸水和試劑IV為百草枯標準品。
[0009]本發(fā)明所述檢測方法，包括如下步驟:
I)標準曲線繪制配制500 μ g/mL的百草枯標準溶液，將其用健康人血清逐級稀釋為10、5、2.5, U0.2,0.08,0.005 μ g/mL的百草枯溶液，與乙腈和20%三氯乙酸溶液按照三者體積比6: I: 1.3混勻，以12000 r /min離心10 min，取100 μ L上清液，加1900 μ L蒸餾水稀釋，12000 r /min離心10 min取上清，以蒸餾水為空白對照，采用紫外分光光度法進行測定，在257 nm測定吸光度值(y)并對質量濃度(x)進行回歸，得線性回歸方程y=0.0935x+0.2964，其相關系數為R2=0.9955，如圖1所示。
[0010]2)樣品的檢測
①取離心好的樣品血清600μ L，先加入除蛋白試劑溶劑I 100 μ L，再加入配好的試劑
II130 μ L，輕輕混勾;12000r/min 離心 1min ；
②取上清液，以蒸餾水調零，在257nm波長下用紫外分光光度儀(或全自動/半自動生化分析儀、酶標儀等)測定吸光度，代入上述方程y=0.0935x+0.2964，得樣品血清中百草枯濃度(μ g/mL)。
[0011 ] 本發(fā)明檢測方法評價
對本發(fā)明檢測方法進行評價，包括重復試驗、回收試驗、線性考查、特異性和干擾試驗等，確定檢測方法的精密度、準確度、線性范圍、特異性和穩(wěn)定性等，最后運用該方法對第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院300余例百草枯中毒患者的血清標本進行血藥濃度檢測，結果顯示該方法穩(wěn)定性好，結果準確性和精密度高。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
本發(fā)明在綜合分析現有檢測方法的基礎上，選擇紫外分光光度法為合適的候選方法，綜合了文獻中的方法，在兼顧靈敏性和精確性的前提下，我們采用一步雙試劑法(乙腈和三氯乙酸)去除蛋白的方法(其中雙試劑的比例尤為此方法的獨到之處，我們試驗了多種試劑和多種比例，均不能很好地實現對樣品的處理和達到測試的理想狀況，此比例為我們得到的最優(yōu)結果)，最大程度地實現了實驗條件優(yōu)化和簡化，最終確定了快速定量檢測血液中百草枯濃度的方法。
【附圖說明】
[0013]圖1健康人血清百草枯的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0015]實驗例I PQ血清檢測方法的臨床應用
病人李某某，女，15歲，某日因和家人發(fā)生口角口服除草劑百草枯溶液約20mL，送醫(yī)院急診經對癥給予洗胃、藥物治療以及血液灌流搶救。分別取患者入院后、第I次血液灌流后lh、第2次血液灌流后Ih的血樣品按上述方法(各試劑的最優(yōu)配比即血清:乙腈:20%三氯乙酸溶液三者體積比6: I: 1.3)混勻，12000r/min離心lOmin，取上清液，以蒸餾水調零，在257nm波長下用紫外分光光度儀測定吸光度，代入方程y=0.0935x+0.2964，得樣品血清中百草枯濃度分別為10.22、8.89、3.56 μ g.mL、
【主權項】
1.一種快速定量檢測血液中百草枯濃度的方法，其特征在于，由除蛋白試劑I和試劑II，溶劑III和百草枯標準品IV組成，所述試劑I為乙腈，試劑II為20%三氯醋酸溶液，溶劑III為雙蒸水。2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，除蛋白試劑I乙腈和試劑II20%的三氯乙酸與血清的比例按照三者體積比1: 1.3: 6，即600 μ L的樣品血清加100 μ L的乙腈和130 μ L的20%三氯乙酸溶液，才能達到最好的除蛋白效果。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，還包括百草枯血清校準品，濃度為2-4 μ g/mL,以健康人血清為基質配制；當檢測系統(tǒng)或檢測試劑發(fā)生改變時，用百草枯血清校準品來校準儀器。4.權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)標準曲線繪制配制500yg/mL的百草枯標準溶液，將其用健康人血清逐級稀釋為10、5、2.5, U0.2,0.08,0.005 μ g/mL的百草枯溶液，與乙腈和20%三氯乙酸溶液按照三者體積比6: I: 1.3混勻，以12000 r /min離心10 min，取100 μ L上清液，加1900 μ L蒸餾水稀釋，12000 r /min離心10 min取上清，以蒸餾水為空白對照，采用紫外分光光度法進行測定，在257 nm測定吸光度值(y)并對質量濃度(x)進行回歸，得線性回歸方程y=0.0935x+0.2964，其相關系數為 R2=0.9955 ； 2)樣品的檢測 ①取離心好的樣品血清600μ L，先加入除蛋白試劑溶劑I 100 μ L，再加入配好的試劑 II 130 μ L，輕輕混勾;12000r/min 離心 1min ； ②取上清液，以蒸餾水調零，在257nm波長下用紫外分光光度儀(或全自動/半自動生化分析儀、酶標儀等)測定吸光度，代入上述方程y=0.0935x+0.2964，得樣品血清中百草枯濃度(μ g/mL)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速定量檢測血液中百草枯濃度方法，檢測方法由除蛋白試劑I和試劑Ⅱ，溶劑Ⅲ和百草枯標準品Ⅳ組成。本發(fā)明還提出了各種試劑的配比，其最優(yōu)化的除蛋白試劑I乙腈和試劑Ⅱ20%的三氯乙酸與血清的比例按照三者體積比1∶1.3∶6，即600μL的樣品血清加100μL的乙腈和130μL的20%三氯乙酸溶液，才能達到最好的除蛋白效果，并且可以離心后直接用于紫外分光光度儀檢測，之后根據標準品曲線得出的計算公式，求得樣品血清中百草枯的準確濃度。本發(fā)明方法能夠快速定量地檢測患者血液中百草枯的濃度，為百草枯中毒的臨床治療提供最快速和有效的依據。
【IPC分類】G01N1/38, G01N21/33, G01N1/28
【公開號】CN105067548
【申請?zhí)枴緾N201510464217
【發(fā)明人】梁秦
【申請人】陜西博世康醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月1日