用于蛋白質(zhì)翻譯起始位點系統(tǒng)檢測的樣品制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及用于蛋白質(zhì)翻譯起始位點系統(tǒng)檢測的樣品制備方法。
【背景技術】
[0002]細胞內(nèi)生物大分子由DNA、RNA以及蛋白質(zhì)組成。其中DNA是遺傳信息的儲存者，RNA是遺傳信息的傳遞者，蛋白質(zhì)是功能執(zhí)行者。遺傳信息由DNA經(jīng)轉錄成為傳遞給RNA，然后RNA經(jīng)翻譯過程將遺傳信息轉化為蛋白質(zhì)。
[0003]目前新一代測序技術即二代測序技術廣泛應用在DNA、RNA序列測定上，因此人們對于DNA、RNA及轉錄過程都有了深入了解，然而對于蛋白質(zhì)翻譯過程缺乏系統(tǒng)有效的研究方法。近來，美國科學院院士 Jonathan S.Weissman建立了基于二代測序的系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)翻譯的方法，命名為核糖體展示技術(ribosome prof iling)，著名測序公司Illumina公司也基于核糖體展示技術開發(fā)了研究蛋白質(zhì)合成的測序試劑盒，這使人們對于蛋白質(zhì)翻譯的認識大大提高。然而核糖體展示技術只能檢測蛋白質(zhì)翻譯效率，并不能準確檢測蛋白質(zhì)翻譯的質(zhì)(即翻譯成什么蛋白質(zhì))。為解決這一問題，我們需要建立蛋白質(zhì)翻譯起始位點的檢測方法。
[0004]為系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)翻譯起始位點，科學家建立了針對體外培養(yǎng)細胞的3種富集翻譯起始核糖體及翻譯起始位點的方法:第一種是利用harringtonine (三尖杉酯堿)固定翻譯起始核糖體大亞基；第一種是利用puromycin (嘌呤霉素)去除延伸核糖體從而相對富集起始核糖體；第三種是細胞培養(yǎng)液中加入Lactimidomycin孵育以固定起始核糖體。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，第一種方法和第二種方法能夠相對富集體外培養(yǎng)的細胞中的翻譯起始核糖體，但數(shù)據(jù)比較亂，第三種方法能有效固定捕獲體外培養(yǎng)的細胞中翻譯起始核糖體。但是這三種方法都不能捕獲組織中翻譯起始核糖體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有產(chǎn)品中不足，提供一種效率高、能夠捕獲細胞/組織中翻譯起始核糖體的用于蛋白質(zhì)翻譯起始位點系統(tǒng)檢測的樣品制備方法。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明用于蛋白質(zhì)翻譯起始位點系統(tǒng)檢測的樣品制備方法，步驟如下:
[0008]一、制備細胞組織裂解液:配制濃度為20mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸、10mM氯化鉀、5mM氯化鎂，5 μ M Lactimidomycin的混合溶液，溶液pH值為7.4 ；
[0009]二、收集細胞，然后將細胞重懸在細胞組織裂解液中，得到混合液A ;
[0010]三、用玻璃珠震蕩破碎混合液A中的細胞:用玻璃珠震蕩振蕩若干秒，在冰上放置若干秒，反復操作若干次；
[0011 ] 四、收集組織，將組織重懸在混合液A中，用研缽研磨組織至破碎，然后在轉速為12000轉每分鐘，溫度為4攝氏度條件下離心10分鐘，收集上清D ;
[0012]五、配制翻譯延伸核糖體去除劑:翻譯延伸核糖體去除劑由Creatinephosphate (肌酸磷酸)、Spermidine (亞精胺)、Creatine phosphokinase (肌酸激酶)、ATP (三磷酸腺甙)、GTP (三磷酸鳥苷)、Puromycin (嘌呤霉素)混合而成；
[0013]六、去除翻譯延伸核糖體:按體積份，提取上清D49份、翻譯延伸核糖體去除劑I份混合均勻后，在溫度為37攝氏度條件下孵化若干分鐘后得到混合液B ;
[0014]七、將混合液B去除未結合核糖體的mRNA:在混合液B中加入RNAse I，在溫度為4攝氏度條件下旋轉消化若干小時得到混合液C ;RNAse I即核糖核酸酶I，RNAse I的濃度為每100微升混合液B溶液中加入100單位RNAse I ;
[0015]八、收集翻譯起始核糖體:在超速離心管中加入0.9ml的濃度為IM的蔗糖溶液，然后在超速離心管中再加入混合液C，在溫度為4攝氏度，轉速為每分鐘90000轉的條件下，離心若干分鐘后，進行過濾后得到沉淀物，然后在沉淀物中加入Iml的Trizol溶液將沉淀物溶解，然后提取RNA，然后對提取的RNA進行高通量二代測序。
[0016]優(yōu)選地，用玻璃珠震蕩振蕩20秒，在冰上放置40秒，反復操作4到6次。
[0017]優(yōu)選地，在溫度為37攝氏度條件下孵化15分鐘后得到混合液B。
[0018]優(yōu)選地，Creatinephosphate (肌酸磷酸)的濃度為 500mM，Spermidine (亞精胺)的濃度為5mM，Creatine phosphokinase (肌酸激酶)的濃度為2mg/mL，ATP (三磷酸腺式)的濃度為40mM，GTP (三磷酸鳥苷)的濃度為10mM，Puromycin (嘌呤霉素)的濃度為ImM。
[0019]優(yōu)選地，在溫度為4攝氏度條件下旋轉消化I小時得到混合液C。
[0020]優(yōu)選地，在溫度為4攝氏度，轉速為90000轉每分鐘的條件下，離心160分鐘。
[0021]本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明在細胞組織裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解細胞或組織，裂解過程中便可固定翻譯起始復合體，然后利用翻譯延伸核糖體去除劑去除延伸核糖體。因此，本發(fā)明的方法既可用于體外培養(yǎng)細胞，也可用于組織樣品；本發(fā)明能夠捕獲組織中翻譯起始核糖體，翻譯效率更高；本發(fā)明在細胞組織裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解細胞或組織，裂解過程中翻譯起始核糖體已經(jīng)固定，因此我們的方法可以達到定量的效果，定量的效果指的是是評價翻譯起始核糖體的多少即翻譯起始效率，因此本發(fā)明可以定量分析。
【附圖說明】
[0022]圖1為HEK293細胞用Harringtonine的mRNA上信號分析結果圖；
[0023]圖2為HEK293細胞用puromycin的mRNA上信號分析結果圖；
[0024]圖3為HEK293細胞培養(yǎng)液中加入Lactimidomycin的mRNA上信號分析結果圖；
[0025]圖4為HEK293細胞用本發(fā)明的方法的mRNA上信號分析結果圖；
[0026]圖5為小鼠肝臟組織用本發(fā)明的方法的mRNA上信號分析結果圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合說明書附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步說明:
[0028]本發(fā)明用于蛋白質(zhì)翻譯起始位點系統(tǒng)檢測的樣品制備方法，步驟如下:
[0029]一、制備細胞組織裂解液:配制濃度為20mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸、濃度為10mM的氯化鉀、濃度為5mM的氯化鎂，濃度為5 μ M Lactimidomycin的混合溶液，溶液pH值為7.4 ；
[0030]二、收集細胞，然后將細胞重懸在細胞組織裂解液中，得到混合液A ;
[0031]三、用玻璃珠震蕩破碎混合液A中的細胞:用玻璃珠震蕩振蕩若干秒，在冰上放置若干秒，反復操作若干次；
[0032]四、收集組織，將組織重懸在混合液A中，用研缽研磨組織至破碎，然后在轉速為12000轉每分鐘，溫度為4攝氏度條件下離心10分鐘，收集上清D ;
[0033]五、配制翻譯延伸核糖體去除劑:翻譯延伸核糖體去除劑由Creatinephosphate (肌酸磷酸)、Spermidine (亞精胺)、Creatine phosphokinase (肌酸激酶)、ATP (三磷酸腺甙)、GTP (三磷酸鳥苷)、Puromycin (嘌呤霉素)混合而成；
[0034]六、去除翻譯延伸核糖體:按體積份，提取上清D49份、翻譯延伸核糖體去除劑I份混合均勻后，在溫度為37攝氏度條件下孵化若干分鐘后得到混合液B ;
[0035]七、將混合液B去除未結合核糖體的mRNA:在混合液B中加入RNAse I，在溫度為4攝氏度條件下旋轉消化若干小時得到混合液C ;RNAse I即核糖核酸酶I，RNAse I的濃度為每100微升混合液B溶液中加入100單位RNAse I ;
[0036]八、收集翻譯起始核糖體:在超速離心管中加入0.9ml的濃度為IM的蔗糖溶液，然后在超速離心管中再加入混合液C，在溫度為4攝氏度，轉速為每分鐘90000轉的條件下，離心若干分鐘后，進行過濾后得到沉淀物，然后在沉淀物中加入Iml的Trizol溶液將沉淀物溶解，然后提取RNA，然后對提取的RNA進行高通量二代測序。
[0037]優(yōu)選地，用玻璃珠震蕩振蕩20秒，在冰上放置40秒，反復操作4到6次。
[0038]優(yōu)選地，在溫度為37攝氏度條件下孵化15分鐘后得到混合液B。
[0039]優(yōu)選地，Creatinephosphate (肌酸磷酸)的濃度為 5OOmM, Spermidine (亞精胺)的濃度為5mM，