一種龍虎人丹植物藥中的14種不揮發(fā)性成分的含量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥成分的含量測(cè)定方法及其質(zhì)量控制方法，具體涉及龍虎人丹植物 藥的含量檢測(cè)法及其質(zhì)量控制方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 龍虎人丹（國藥準(zhǔn)字Z20025168)創(chuàng)制于1909年，由黃楚九先生根據(jù)古方"諸葛行 軍散"化裁而來，主要由薄荷腦、丁香、肉桂、兒茶、甘草等十一味中藥構(gòu)成，其功能主治為清 暑開竅，辟穢排濁，驅(qū)風(fēng)健胃。1923年"龍虎牌"和"人丹及圖案"商標(biāo)向政府申請(qǐng)并獲核 準(zhǔn)，成為國內(nèi)第一個(gè)規(guī)范的醫(yī)藥注冊(cè)商標(biāo)，是上海乃至中國的民族制藥工業(yè)發(fā)端的標(biāo)志。百 年來龍虎人丹產(chǎn)品銷售經(jīng)久不衰，成為銷售過億的獨(dú)家傳統(tǒng)中藥品種。
[0003] 由于龍虎人丹由中藥制成，受到藥物產(chǎn)地、采收季節(jié)及制備工藝等多種因素的影 響，制成的制劑在確保療效一致性上具有較大難度。因此，有必要對(duì)龍虎人丹植物藥的成分 的組成和含量進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。目前，關(guān)于龍虎人丹的質(zhì)量控制方法主要有顯微鑒別、 薄層鑒別、高效液相色譜法和氣相色譜法，張玉杰等利用氣相色譜法測(cè)定其中冰片、薄荷腦 的含量，上述方法只針對(duì)龍虎人丹中的單個(gè)成分，檢測(cè)時(shí)間較長，樣品檢測(cè)前處理步驟復(fù)雜 等。到目前為止，未見有關(guān)龍虎人丹中同時(shí)檢測(cè)多種成分的研究報(bào)道，無該復(fù)方中（1)兒茶 素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾 酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內(nèi)酯、（13)去 氫木香內(nèi)酯、（14)甘草次酸的同時(shí)測(cè)定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要目的是利用液相色譜-LCQ離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)龍虎人丹植物 藥中14種不揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析，確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：
[0006] -種龍虎人丹植物藥中14種不揮發(fā)性成分含量的檢測(cè)方法，該方法由以下步驟 組成：
[0007] (1)配制供試品溶液：取龍虎人丹植物藥用溶劑配制成0.3~2mg /ml的供試品 溶液；
[0008] 配制對(duì)照品溶液：精密稱取對(duì)照品適量，置于10mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋 至刻度。搖勻，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4°C冰箱保存。
[0009]精密量取各儲(chǔ)備液適量，用乙腈-水（30 : 70,v / v)稀釋,得各對(duì)照品的混合標(biāo) 準(zhǔn)溶液。
[0010] 按進(jìn)樣量為1~20 i! L對(duì)Thermo BDS Hypersil C18色譜柱進(jìn)樣，控制柱溫為 20°C~40°C，接著用由A相和B相組成的流動(dòng)相以0. 2~1. 5mL / min的速度按照表1的 程序進(jìn)行梯度洗脫，同時(shí)利用液相色譜-LCQ離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)洗脫液，獲得供試品 藥物及對(duì)照品藥物的離子色譜圖；
[0011]表 1
[0013] (2)所得對(duì)照品溶液的離子色譜圖從左至右分別為兒茶素、表兒茶素、夏佛托苷、 甘草苷、異甘草苷、甘草素、刺甘草查爾酮、甘草酸、異甘草素、胡椒堿、甘草查爾酮A、木香烴 內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、甘草次酸，供試品的離子色譜圖與對(duì)照品溶液的圖譜此較，相應(yīng)成分 的保留時(shí)間相同的峰即是與該成分相同物質(zhì)的特征峰，每個(gè)成分按表4內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 含量；
[0014]表 4
[0016] (1)兒荼素、（2)表兒荼素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內(nèi)酯、（13)去氫木香內(nèi)酯、（14)甘草次酸
[0017] 上述步驟中，
[0018] 配制供試品溶液或?qū)φ掌啡芤核玫娜軇?0~40%的乙腈，或者是與之流動(dòng) 性相似的溶劑；
[0019] 所述流動(dòng)相A相為純水含0? 005~0? 015%甲酸（含0? 2mM甲酸銨）；
[0020] B相為乙腈；
[0021] 實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜條件為：LCQ離子阱質(zhì)譜，離子源為ESI，離子噴霧電壓5000V(+)、 4500V (-)，鞘氣壓30psi，輔助氣壓5psi，毛細(xì)管電壓26V (+)、-37V (-)，毛細(xì)管溫度300°C。 掃描方式為全掃描模式。
[0022] 本發(fā)明中供試品溶液的制作方法為：龍虎人丹粉碎成細(xì)粉，稱取龍虎人丹粉末 30mg，加30 %乙腈lOmL，超聲處理20min，稱定重量，補(bǔ)足所失重量，12000rpm離心10min后 取上清，進(jìn)樣。
[0023] 本發(fā)明中供試品溶液的制作方法還可以采用加熱回流法，即龍虎人丹粉碎成細(xì) 粉，稱取龍虎人丹粉末30mg，加10mL20-40 %乙腈，加熱回流20-30min，10000-15000rpm離 心lOmin后取上清，進(jìn)樣。
[0024] 本發(fā)明中優(yōu)選的梯度洗脫程序如表2。
[0025]表 2
[0027] 本發(fā)明中最優(yōu)選的梯度洗脫程序如表3。
[0028]表 3
[0030] 本發(fā)明中在供試品配制過程中的稀釋溶劑為30%的乙腈。
[0031] 本發(fā)明中在供試品溶液的制作過程中所使用的乙腈溶劑濃度可以放寬范圍至 20-40%。
[0032] 本發(fā)明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供試品溶液的制作過程中所使用的乙 腈溶劑。
[0033] 本發(fā)明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供試品溶液的加熱回流法制作過程中 所使用的乙腈溶劑。
[0034] 本發(fā)明中對(duì)照品溶液配制過程中稀釋劑乙腈-水的此例可選擇為20-40%。
[0035] 本發(fā)明中在配制對(duì)照品溶液過程中可以使用丙酮或甲醇替代稀釋溶劑乙腈。
[0036] 本發(fā)明中在配制供試品溶液中的流動(dòng)相A為純水含0. 01%甲酸（含0. 2mM甲酸 銨）。
[0037] 本發(fā)明方法測(cè)試中發(fā)現(xiàn)14種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限、各成分的檢測(cè)離 子見表4,結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)十四種成分的線性關(guān)系良好。
[0038]表 4
[0039]
[0040] (2)兒茶素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內(nèi)酯、（13)去氫木香內(nèi)酯、（14)甘草次酸
[0041] 本發(fā)明方法中的精密度試驗(yàn)結(jié)果為14種成分的RSD〈4. 46%，表明精密度良好。準(zhǔn) 確度考察結(jié)果見表5,14種成分的回收率在94. 41-103. 39%之間，RSD〈6. 05%，表明準(zhǔn)確度 良好。
[0042]表 5
[0044] (1)兒茶素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內(nèi)酯、（13)去氫木香內(nèi)酯、（14)甘草次酸
[0045] 本發(fā)明方法中的重現(xiàn)性結(jié)果見表5, RSD在0. 66-4. 99%之間，結(jié)果表明樣品重現(xiàn) 性良好。
[0046] 穩(wěn)定性考察顯示，4°C條件下，龍虎人丹樣品溶液至少24h內(nèi)穩(wěn)定（RSD〈4. 69%)。
【附圖說明】
[0047] 圖1為總離子色譜圖，其中A:在負(fù)離子模式下的混合對(duì)照品圖；B:正離子模式下 的混合對(duì)照品圖；C:負(fù)離子模式下的樣品圖；D:正離子模式下的樣品圖；（1)兒茶素、（2) 表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾酮、（8)甘 草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內(nèi)酯、（13)去氫木香內(nèi) 酯、（14)甘草次酸。
[0048] 圖2為對(duì)照品A和樣品B中的提取離子色譜圖：⑴兒茶素、⑵表兒茶素、⑶夏 佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草 素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內(nèi)酯、（13)去氫木香內(nèi)酯、（14)甘草次酸
【具體實(shí)施方式】
[0049] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本方面做進(jìn)一步的描述。
[0050] 實(shí)施例一