高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物飼料的檢測領(lǐng)域，特別是一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樣品前處理是分析檢測過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是濃縮被測定的痕量組分，提高方法的 靈敏度，及除去對分析系統(tǒng)有干擾的物質(zhì)的重要手段。萃取是從樣品集體中分離出目標(biāo)化 合物的一項(xiàng)技術(shù)，是樣品預(yù)處理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是應(yīng)用最廣泛的 樣品制備方法之一，但是，傳統(tǒng)的液液萃取的操作繁瑣費(fèi)時(shí)、有機(jī)溶劑消耗量大，而且容易 出現(xiàn)乳化現(xiàn)象的缺陷，使得在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。
[0003] 1998年，科學(xué)家提出了在傳統(tǒng)的液液萃取的基礎(chǔ)上，利用一種具有吸附性和較大 的比表面積的惰性多空填料作為介質(zhì)，建立的一種新型高效樣品的制備方法-介質(zhì)液液萃 ?。╯upported liquid extraction簡稱SLE)，SLE萃取技術(shù)就是選用一種多孔性惰性材 料-煅燒硅藻土作為介質(zhì)，取代分液漏斗，增大了兩相接觸時(shí)的作用面積，實(shí)現(xiàn)高效、快速 的萃取過程。
[0004] 當(dāng)水溶液樣品加樣到固定的聚丙烯注射管中的煅燒硅藻土上后，經(jīng)過一定時(shí)間 (一般分為幾分鐘），水相溶液以一層薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，將有機(jī)溶劑 從柱管上端加入，當(dāng)互不相溶的兩相在硅藻土表面接觸的同時(shí)萃取立即發(fā)生，最后萃取液 在重力作用下流出，必要情況下，可以施加較小的壓力，而水相保留在介質(zhì)中。盛接的流出 液直接將溶劑吹干，復(fù)溶后，即可用于下一步分析檢測。
[0005] 農(nóng)業(yè)部1025號公告-11-2008公開了豬尿中β -受體激動(dòng)劑多殘留檢測，其采用 酶解后異丙醇-乙酸乙酯進(jìn)行萃取，并通過內(nèi)標(biāo)法可以得到相關(guān)的檢測結(jié)果，但是在實(shí)際 應(yīng)用中，采用酶解后然后在采用傳統(tǒng)方法萃取后通過色譜檢測有時(shí)無法檢出殘留項(xiàng)。如何 提高豬尿中的克侖特羅含量的測量精度是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要考慮的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種分離效果好、有利于后續(xù)測試工作進(jìn)行的高精度測量 豬尿中的克侖特羅含量的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，包括以下 步驟：
[0008] 步驟1 :樣品預(yù)處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4倍于 豬尿體積的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液；
[0009] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱后，靜置2~4分鐘；
[0010] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅 的洗脫液；
[0011] 步驟4 :采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進(jìn)行檢測，同時(shí)采用不同濃度 的克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，所述的高效液相色譜法的具體參數(shù)為：
[0012] 色譜柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID
[0013] 柱溫：室溫
[0014] 流動(dòng)相：0. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的體 積比為100:12 ;
[0015] 檢測器：UV檢測器；
[0016] 檢測波長：2IOnm;
[0017]進(jìn)樣量：5〇yL;
[0018] 其中，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸 甲酯的重量比為1:0. 5~1。
[0019] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的豬尿?yàn)閘g，緩沖溶 液為4ml，步驟2中所取的上清液為0. 5ml，所述的步驟3中，每次洗脫時(shí)所用的洗脫劑為 0. 5ml 〇
[0020] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的三氯乙酸和豬尿的 質(zhì)量比為1:98~100。
[0021] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的步驟1中，漩渦混合 器混合處理的時(shí)間為0. 5~1分鐘。
[0022] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的步驟1中，所述的離 心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以9000~11000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離 心0· 5~1分鐘。
[0023] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的SLE柱為奧秘山東 科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE柱，所述的高效液相色譜法所采用的儀器型號為 LC-2010型高效液相色譜儀。
[0024] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0025] 采用SLE法分離豬尿中的克侖特羅，省略掉酶解步驟，并且采用緩沖溶液進(jìn)行混 合，然后通過SLE柱分離出克侖特羅，萃取劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯，本發(fā)明的分離效率 好、分離時(shí)間短，同時(shí)結(jié)合HPLC法測量萃取得到的洗脫液，能夠準(zhǔn)確的測量豬尿中的克侖 特羅的含量，本發(fā)明的洗脫劑與傳統(tǒng)的洗脫劑相比，其測量精度提高了 9.99%。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:99 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn) /分鐘的速度離心0.8分鐘。
[0029] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置3分鐘；
[0030] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 8。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:98 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以9000轉(zhuǎn)/ 分鐘的速度離心1分鐘。
[0033] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置2分鐘；
[0034] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:1。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:99 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn) /分鐘的速度離心0.5分鐘。
[0037] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置4分鐘；
[0038] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 5。
[0039] 標(biāo)準(zhǔn)樣的制備
[0040] 稱取克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度彡99% )0· OlOOg，置于1000 ml容量瓶中，用重量比為 1:0. 8的乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物的溶劑溶解定容，其濃度為10 μ g/ml ;
[0041] 取上述濃度為10 μ g/ml的克侖特羅溶液于1000ml容量瓶中，配制成為2 μ g/L、 5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L 的標(biāo)準(zhǔn)樣。
[0042] 對比例I
[0043] 與實(shí)施例1大體相同，不同的地方在于，步驟3中，洗脫劑為異丙醇與乙酸乙酯的 混合物，其體積比為60:40。
[0044] 分析：
[0045] 檢測方法具體為：
[0046] 儀器：LC-2010型高效液相色譜儀（日本島津）
[0047] 色譜柱：C18 柱，I5Omrn*3. 9HimID
[0048] 柱溫：室溫
[0049] 流動(dòng)相：0. 05%磷酸水溶液：乙腈=100:12 ;
[0050] 檢測器：UV檢測器；
[0051] 檢測波長：2IOnm;
[0052] 進(jìn)樣量：50 μ L
[0053] 以2 μ g/L、5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L的標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行測試，回歸方程為Y = 10750X+0. 5, R2= 0. 9991，X為待測物濃度，Y為峰面積。
[0054] 取同一份豬尿1kg，按照實(shí)施例1的方法制備10份萃取樣品A標(biāo)號為A1-A10,按 照對比例1的方法制備10份萃取樣品B標(biāo)號為B1-B10。
[0055] 按照上述檢測方法進(jìn)樣檢測，得到如下的檢測結(jié)果：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :樣品預(yù)處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4倍豬尿體 積的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液； 步驟2 :將上清液加入到SLE柱后，靜置2~4分鐘； 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，每次洗脫時(shí)所用的洗脫劑為0. 5ml，接 收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗脫液； 步驟4 :采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進(jìn)行檢測，同時(shí)采用不同濃度的克 侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，所述的高效液相色譜法的具體參數(shù)為： 色譜柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID 柱溫:室溫 流動(dòng)相：〇. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的體積比 為 100:12 ; 檢測器：uv檢測器； 檢測波長：210nm ; 進(jìn)樣量：50yL ; 其中，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸甲酯 的重量比為1:0. 5~1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的豬尿?yàn)閘g，緩沖溶液為4ml，步驟2中所取的上清液為0. 5ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的三氯乙酸和豬尿的質(zhì)量比為1:98~100。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的步驟1中，漩渦混合器混合處理的時(shí)間為0. 5~1分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的步驟1中，所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以9000~ 11000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心0. 5~1分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，包括以下步驟：步驟1：樣品預(yù)處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入80％VOL的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液；步驟2：將上清液加入到SLE柱后，靜置2～4分鐘；步驟3：采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗脫液，步驟4：采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進(jìn)行檢測。本發(fā)明的目的在于提供一種分離效果好、有利于后續(xù)測試工作進(jìn)行的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104807909
【申請?zhí)枴緾N201510238890
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 郭振旺, 黃蘅, 吳嵐, 鄧水德, 黎志銳
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月12日